文档介绍：米氏常数测定方法
酶活米氏常数实验
一、实验前准备
1、24孔板洗净烘干,准备足够枪头。
2、准备催化剂,在光下呈透明状为分散性较好,否则用超声清洗器(位于化学间)超声分散5min,期间准备底物(如TMB或者ABTS),浓度依照自己实验的要求定(10mg/mL或5mg/mL),一般1mL足够用,。TMB(外间冰箱上层)溶于DMSO(二甲亚砜,位于化学间王春雨的柜子里),ABTS(与TMB放在一起)溶于二次水。
3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200μL和10μL移液枪、50μL排枪(位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中)、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中,放到对面酶标仪前,开空调定室温(25℃,提醒其他人随手关门),24孔板中其中一排加入适量H2O2(每孔1mL左右,注意避光,可在板上盖一张卷纸),将缓冲液、催化剂、底物放实验台上,-1h。 4、记录本上提前写好实验的加样顺序:
催化底物TMB(或ABTS)的酶促动力学过程加样顺序:①200μL缓冲液②10μL催化剂③底物TMB(ABTS)(0,,1,2,4,6,8,10μL) ④32μLH2O2(排枪加) 催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序:①200μL缓冲液②10μL催化剂③H2O2(2,4,6,8,10,16,32,64μL) ④10μL底物TMB(ABTS)(排枪加)
数据记录按下表记,Code为每次读板时的微孔板编号,Time为对应
的读板时的时间,一般30s读板一次,可根据反应的快慢来确定读板的时间。 Code Time TMB V01
Code Time H2O2 V01 二、实验
1、打开酶标仪(开关在仪器后部,若仪器没反应,请检查电源是否接通),密码为5个
1 2
2 4
3 6
4 8
5 10
6 16
7 32
64
1 0
2
3 1
4 2
5 4
6 6
7 8
10
0,按Enter键进入系统。电脑开机,密码为mby-nano,双击酶标仪
软件图标,出
现登录
框,直接点击“登录”,进入酶标仪控制界面
,若底物为TMB,
选择“铁动力学”(波长为
650nm)
,选择模
板1
打开电脑内置时; 钟
,
若底物为ABTS,则检验项目选择“gg”(波长为405nm)
。
新建一个word文档,以日期命名,打开。
2、加样:96孔板从左至右编号为1-12,自上而下编号为A-H。以TMB为例,从第1列加样:
①从A1至H1,每孔加200μL NaAc/HAc Buf; ②从A1至H1,每孔加10μL催化剂(每加一个孔,换一次枪头,加样时用枪头搅匀反应体系); ③从A1至H1,每孔分别加不同体积(0,,1,2,4,6,8,10μL)TMB(每加一个孔,换一次枪头,加样时用枪头搅匀反应体系);
④用排枪吸取32μL H2O2加入A1至H1,快速放入酶标仪中,点击“读板”,记下读板时间(如下表所示,假设第一次读板时间为09:00:00) Code Time TMB
用排枪加H2O2时,注意检查枪头是否插紧,否则会导致吸取H2O2的量不足。亦可先将