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近几天答复了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比拟系统的论述。特奉献了western显影常见问题及解决方案，是我的经历总结，以供大家参考。其中绝大局部问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。限于字数，语言比拟简洁，如对其中容有疑问或建议可跟帖。
Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光那么压10~30s，看不到那么同时压两，10~30min洗一，如果无那么再补一,1h后洗。再无，那么压过夜。共3片，根据每次结果调整。
其中两片子的压法如下描述: 先剪一比膜长2~3厘米的片子〔以供贴胶带〕，然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边〔贴时胶带留一半用于粘到封口膜上〕，然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。这样就固定了第一胶片，就不会因为放、取第二胶片而使第一移动了。然后放第二胶片，与第一片子贴在一起就行，注意片子要枯燥，压片前用纸擦干封口膜，以防止被底物液体污染导致与下面一粘在一起。取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一错开了，不要用手抠，否那么下面一也移动了。 在洗下面一片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否那么在胶带的地方会影响显影。荧光经过下面一胶片会稍微有些衰减，所以下面一胶片感光稍微比上面一强一些。
现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因 - - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决
反影(白色条带,黑色背景) ---- -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - ---- - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1
显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2
信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3
--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4
- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注5
-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物 *注6
高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7
---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间缺乏- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8
--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有穿插----- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9
--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱缺乏 - - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10
---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长 - - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间