文档介绍：Western Blotting
汇报人：赵丽
Western blotting 中文名称为免疫印迹，其程序是对经处理的样本（血清、培养细胞和组织匀浆）先进行SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳（SDS-PAGE),以分离蛋白。然后将电泳后的分离开的蛋白转移至具有结合力的膜上。对印迹膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。最后对膜上的蛋白质进行检测。
Western blotting 实验简介
方法优点
SDS-PAGE:高分辨力
固相免疫测定：高特异性、敏感性
Western Blotting 方法
优点：
（一种抗体）
缺点：
,使用不方便
一: 直接法
Western Blotting 方法
优点：
1. 免疫特异性不受标记影响
2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）
3. 多种标记的二抗可供选择
4. 可选择不同的Marker
缺点：
1. 交叉反应引起的非特异性条带
2. 额外的二抗孵育以及条件优化
二、间接法
基 本 流 程
蛋白的提取
倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液
每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（ ～）。平放轻轻 摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
按1ml裂解液加10 l PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
每瓶细胞加400 l含PMSF的裂解液，于冰上裂解20min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），。（整个操作尽量在冰上进行。）
蛋白的提取
每瓶细胞加400 l含PMSF的裂解液，于冰上裂解20min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），。（整个操作尽量在冰上进行
于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）
－20℃保存。
配10％分离胶
加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用枪吸取，胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
配4％的浓缩胶
加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板)