文档介绍：马玉超
北京林业大学生物科学与技术学院
办公地点：生物楼117；电话：62336016；
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现代微生物学实验技术
实验内容
♣16S rRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析
♣染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列
♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达
♣ 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性
♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取
16S rRNA基因的PCR扩增、电泳
及系统发育分析
窦桂铭
PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
设想—实现—改进与完善
72℃
94℃
55℃
PCR循环
PCR技术的反应原理
PCR技术的反应原理
DNA或RNA模板
5´
5´
待扩增DNA区域
3´
94℃ 5 min
5´
5´
55℃
退火
5´
5´
聚合
3´
3´
5´
5´
3´
循环25-30次
变性
70℃
DNA引物
DNA聚合酶
dNTPs
Mg2+（缓冲液）
1
2
①
5´
5 ´
目的基因
变性
加热
5 ´
5 ´
引物
退火
5 ´
5 ´
底物
延伸
5 ´
5 ´
5 ´
加热
变性
5 ´
退火引物
2
30个循环：230
目标DN***段达106-107
变性－退火－延伸
5 ´
5´
2
4
5 ´
5 ´
5´
5 ´
5 ´
延伸
5´
5 ´
5 ´
5 ´
5 ´
一个标准的PCR过程
核酸的凝胶电泳
基本原理
当一种分子被放置在电场中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。
这种电泳分子在电场作用下的迁移速度——电泳的迁移率。
迁移率的影响因素：电场长度、电泳分子的电荷数量、电泳分子与支持介质的摩擦系数等。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的——叫做多聚阴离子。方向：负→正
种类：
水平
垂直
琼脂糖
聚丙烯酰***
普通DNA
RNA
小分子量
核酸
二、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖：线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。
加热→凝固：网孔状的电泳介质，密度由琼脂糖的浓度决定。
琼脂糖凝胶分辨DN***段的能力
琼脂糖凝胶分辨DN***段的范围: -50kb
凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）
% 1,000～30,000
% 800～12,000
% 500～10,000
% 400～7,000
% 200～3,000
% 50～2,000
琼脂糖
DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响：
核酸
分子量的大小
分子状态
物理
电压
缓冲液
温度