文档介绍:马玉超北京林业大学生物科学与技术学院办公地点:生物楼117;电话:62336016;Email:myc0307@现代微生物学实验技术实验内容♣16SrRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析♣染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列♣大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达♣利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性♣绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取16SrRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析窦桂铭实验目的掌握PCR的原理,增强对PCR重要性的认识;掌握电泳技术及系统发育分析的方法,为将来课题研究奠定基础。PCR(PolymeraseChainReaction)法,又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术,是一种高效快速的体外DNA聚合程序设想—实现—改进与完善72℃94℃55℃PCR循环PCR技术的反应原理PCR技术的反应原理DNA或RNA模板5´5´待扩增DNA区域3´94℃5min5´5´55℃退火5´5´聚合3´3´5´5´3´循环25-30次变性70℃DNA引物DNA聚合酶dNTPsMg2+(缓冲液)12①5´5´目的基因变性加热5´5´引物退火5´5´底物延伸5´5´5´加热变性5´退火引物230个循环:230目标DN***段达106-107变性-退火-延伸5´5´245´5´5´5´5´延伸5´5´5´5´5´一个标准的PCR过程核酸的凝胶电泳基本原理当一种分子被放置在电场中时,它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度——电泳的迁移率。迁移率的影响因素:电场长度、电泳分子的电荷数量、电泳分子与支持介质的摩擦系数等。在生理条件下,核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的——叫做多聚阴离子。方向:负→正种类:水平垂直琼脂糖聚丙烯酰***普通DNARNA小分子量核酸二、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖:线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。加热→凝固:网孔状的电泳介质,密度由琼脂糖的浓度决定。琼脂糖凝胶分辨DN***段的能力琼脂糖凝胶分辨DN***段的范围:-50kb凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围(bp)%1,000~30,%800~12,%500~10,%400~7,%200~3,%50~2,000琼脂糖