文档介绍：马玉超马玉超北京林业大学生物科学与技术学院北京林业大学生物科学与技术学院办公地点:生物楼办公地点:生物楼 117 117 ;电话: ;电话: 62336016 62336016 ; ; Email:myc0307@ Email:myc0307@ 现代微生物学实验技术现代微生物学实验技术实实验验内内容容? 16S rRNA 基因的 PCR 扩增、电泳及系统发育分析?染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列?大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达?利用 SDS-PAGE 分析融合蛋白的可溶性?绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取 16S rRNA 基因的 PCR 扩增、电泳及系统发育分析窦桂铭实验目的 PCR 的原理,增强对 PCR 重要性的认识; ,为将来课题研究奠定基础。 PCR ( Polymerase Chain Reaction )法,又称为聚合酶链反应或 PCR 扩增技术,是一种高效快速的体外 DNA 聚合程序 PCR ( Polymerase Chain Reaction )法,又称为聚合酶链反应或 PCR 扩增技术,是一种高效快速的体外 DNA 聚合程序设想设想——实现实现——改进与完善改进与完善 72 72 ℃℃ 94 94℃ 55 55 ℃℃ PCR PCR 循环循环 PCR 技术的反应原理 PCR 技术的反应原理 PCR 技术的反应原理 PCR 技术的反应原理 DNA 或 RNA 模板 DNA 或 RNA 模板 5′ 5′5′ 5′ 待扩增 DNA 区域待扩增 DNA 区域 3′ 3′ 94 ℃ 5 min 94 ℃ 5 min 5′ 5′5′ 5′ 55 ℃ 55 ℃退火退火 5′ 5′5′ 5′聚合聚合 3′ 3′3′ 3′ 5′ 5′5′ 5′ 3′ 3′循环 25-30 次循环 25-30 次变性变性 70 ℃ 70 ℃ DNA 引物 DNA 引物 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 dNTPs dNTPs Mg 2+(缓冲液) Mg 2+(缓冲液) 12 ① 5′ 5′5′ 5′目的基因目的基因变性变性加热加热 5′ 5′5′ 5′引物引物退火退火 5′ 5′5′ 5′底物底物延伸延伸 5′ 5′ 5′ 5′5′ 5′加热加热变性变性 5′ 5′退火引物退火引物 2 2 30个循环: 2 30 目标 DNA 片段达 10 6 -10 730个循环: 2 30 目标 DNA 片段达 10 6 -10 7变性-退火-延伸 5′ 5′5′ 5′ 24 5′ 5′5′ 5′5′ 5′ 5′ 5′5′ 5′延伸延伸 5′ 5′5′ 5′5′ 5′5′ 5′5′ 5′一个标准的 PCR 过程核酸的凝胶电泳基本原理当一种分子被放置在电场中时,它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度——电泳的迁移率。迁移率的影响因素:电场长度、电泳分子的电荷数量、电泳分子与支持介质的摩擦系数等。在生理条件下,核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的——叫做多聚阴离子。方向:负→正种类: 水平垂直琼脂糖聚丙烯酰***普通 DNA RNA 小分子量核酸二、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖:线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。加热→凝固:网孔状的电泳介质,密度由琼脂糖的浓度决定。琼脂糖凝胶分辨 DNA 片段的能力琼脂糖凝胶分辨 DNA 片段的范围: -50kb 凝胶浓度线形 DNA 的最佳分辨范围( bp) % 1,000 ~30,000 % 800 ~12,000 % 500 ~10,000 % 400 ~7,000 % 200 ~3,000 % 50 ~2,000 琼脂糖