文档介绍：生化检验技术基础 与进展
上海长征医院实验诊断科
于嘉屏
一、比色分析
――Beer-Lambert 定律
A = lg(I0/I)=KCL 或 I=I0×10-KCL
I0:入射光强度
I:透过光强度
K:常数
C:溶液浓度
L:溶液的厚度
(1)郎伯定律
I0 It
l
L
-dI∝Idl, -dI=aIdl, dI/I=-adl
积分 It L
dI/I = -a dl 得: ln(I0 / It)=-aL
I0 0
将ln改为lg,则为:lg( I0 / It)=-=K’L
令lg( I0 / It) =A,则A= K’L
(2)比尔定律
A=K”C
(3)郎伯-比尔定律
A=KLC
透光率(transmittance,T,透射率)
T=I / I0
吸光度(absorbance,A)
光密度(eptical density,D或OD)
A=lg I0/I=-lgT
T=10-A=10-KCL
A=KCL
当L用cm,C用mol/L表示,则K即称之为摩尔吸光系数,用ε表示。
当C=1mol/L,L=1cm,则ε=A。
T%与A的关系
---------------------
透光率(T) 吸光度(A)
---------------------
1
---------------------
(1)化学因素的影响
溶液中溶质可因浓度的改变而发生离解、缔合,与溶剂间的作用等原因而出现偏离比尔定律的现象。由化学因素引起的偏离,有时可控制溶液条件设法减免。此外,能产生荧光的物质也可导致偏离比尔定律。
(2)非单色光的影响
比尔定律的一个重要条件是单色光,但在比色分析中常有不同波长的光同时存在。这就使吸光度发生改变,从而偏离比尔定律。
波长的选择
可见
绿色带黄
深黄
桔红
深红
深紫
青紫
紫蓝
蓝色带绿
绿色带蓝
深绿
Ultra-violet
紫外
200~400
深紫
深红
桔红
深黄
绿色带黄
暗绿
绿色带蓝
蓝色带绿
紫蓝
青紫
被测溶液颜色
颜色
750~800
610~750
595~610
560~580
580~595
500~560
490~500
480~490
435~480
400~435
波长(nm)
(3)光学因素的影响
散射是向空间各个方向,而使透射光减弱。反射可使光能损失,当光线通过两种不同介质时,则发生反射。当样本溶液与空白溶液的折射率有较大差异时,导致吸收值的偏差。
(4)非平行光通过吸收池时,由于光线的倾斜使厚度L增大而影响测量值。