文档介绍：生物技术 084 张权 20080134404 基因工程在乳糖酶基因方面的具体应用乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质,还含有免疫球蛋白等抗病因子,易被人体消化吸收,是人类改善营养、增强体质的理想食品。除此之外,在牛乳等制品当中还含有 5% 左右的乳糖,它是牛奶中主要的碳水化合物,对人体有着重要的作用。主要表现在于乳糖能促进钙质吸收及整理肠道的功效,特别是乳糖被分解后的半乳糖是婴儿脑发育的必需物质,与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。然而,人体却不能直接利用乳糖,它必须被乳糖酶分解为单糖的葡萄糖及半乳糖后才能被吸收和利用。据研究发现,世界各国人口都有不同程度的乳糖酶缺乏,东方人乳糖酶缺乏高达 85% , 从而导致“乳糖不耐症”的发生。乳糖酶(EC3 .,又名β拟半乳糖苷酶)能将牛乳中的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,并具有半乳糖苷的转移作用[ 3]。利用该酶生产低乳糖制品或口服酶制剂,能够有效解决“乳糖不耐症”问题。乳糖酶广泛存在于扁桃、桃、杏、苹果和咖啡豆等植物中,大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和霉菌等微生物中,以及有效哺乳动物的小肠等器官和皮肤组织中。然而,不同来源的乳糖酶,其酶学性质相差很大。本研究从保加利亚德氏乳杆菌中成功的克隆出乳糖酶基因,并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征,为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。 1 材料与方法 材料 菌株与质粒保加利亚德氏乳杆菌购买于广东省微生物研究所菌种保藏中心;大肠杆菌 DH5 α由本室保存; pGM 拟 T vector 购于北京天根生化科技有限公司。 试剂材料细菌培养试剂购于 Sigma 公司;引物由上海生工合成; LA DNA 聚合酶购于自大连宝生物公司;细菌基因组提取试剂盒、 DNA 胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、 DNA Ladder 购于北京天根生化科技有限公司; T4 连接酶、琼脂糖、荧光染料由本室保存。 方法 保加利亚德氏乳杆菌基因组 DNA 的提取用灭菌双蒸水溶解干冻管里的保加利亚德氏乳杆菌,并划平板到 MRS 固体培养基, 37℃培养 72h,挑取单个菌落于 MRS 液体培养基进行增菌( 37℃摇床)。利用细菌基因组提取试剂盒提取保加利亚德氏乳杆菌基因组 DNA ,并用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测纯度。 引物设计与合成从 GenBank 数据库中检索到保加利亚德氏乳杆菌中乳糖酶基因序列( GenBank 序列号: GI149564 )设计引物如下: P1 :5'拟5' GCGATG AGC AA TAAGTTA 拟 3'; P2 : 5'GCTCGAGCGGTTATTTTAGTAAAAGGG 拟3'。上述引物由大连宝生物工程有限公司合成(下划线碱基分别为 BamH I和 Xho I酶切位点)。 乳糖酶基因的 PCR 扩增与鉴定反应总体积为 25μL:模板 DNA(1 μ g/μ L)3μL, 10× μ L,Mg2+( 25 mM) μ L, dNTP(2 . 5 mM) μ L,引物 P1(10 pmol /μ L) μ L,引物 P2 (10 pmol /μ L) μ L,LA DN