文档介绍：PCR技术简介
PCR常见问题、原因分析及其解决方案
提高PCR反应特异性的策略
主讲内容
PCR技术简介
第一页，共31页。
PCR标准反应体系
DNA模板
引物
反应缓冲液
dNTP
ddH2O
Amplificaiton System
特别适用于保真度较高的 超长片段扩增
第十四页，共31页。
PCR MasterMix
原 理
预配好的PCR反应液
DNA聚合酶
反应缓冲液
dNTP
PCR增强剂
第十五页，共31页。
PCR Master Mix
特 点
快速简便 减少加样误差和污染
灵敏度高 可扩增低至2个拷贝的目的模板
特异性强 降低PCR反应的要求，增强特异性
稳定性好 长期放置活性无改变
适用范围
大规模基因检测
目的基因拷贝数极低的样本
GC含量高,有二级结构的模板
复杂基因组样本
可直接检测菌落，基因点突变检测,
或者阳性克隆的筛选。
第十六页，共31页。
PCR技术简介
PCR常见问题、原因分析及其解决方案
提高PCR反应特异性的策略
PCR常见问题、原因分析及其解决方案
第十七页，共31页。
PCR常见问题
无扩增产物
非特异性扩增
拖尾
假阳性
第十八页，共31页。
PCR常见问题之一
无扩增产物
模板:含有抑制物，含量低
Buffer对样品不合适
引物设计不当或者发生降解
反应条件：退火温度太高，延伸时间太短
原因
对
策
纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
更换Buffer或调整浓度
重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物
降低退火温度、延长延伸时间
现象：正对照有条带，而样品则无；
第十九页，共31页。
PCR常见问题之二
非特异性扩增
现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
第二十页，共31页。
PCR常见问题之二
引物特异性差
模板或引物浓度过高
酶量过多
Mg2+浓度偏高
退火温度偏低
循环次数过多
原因
对
策
重新设计引物或者使用巢式PCR
适当降低模板或引物浓度
适当减少酶量
降低镁离子浓度
适当提高退火温度或使用二阶段温度法
减少循环次数
非特异性扩增
第二十一页，共31页。
PCR常见问题之三
拖尾
现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
M 1 2
第二十二页，共31页。
PCR常见问题之三
模板不纯
Buffer不合适
退火温度偏低
酶量过多
dNTP、Mg2+浓度偏高
循环次数过多
原因
对
策
纯化模板
更换Buffer
适当提高退火温度
适量用酶
适当降低dNTP和镁离子的浓度
减少循环次数
拖尾
第二十三页，共31页。
PCR常见问题之四
假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)
原因：靶序列或扩增产物的交叉污染
现象：空白对照出现目的扩增产物
对策：
操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；
除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
第二十四页，共31页。
PCR技术简介
PCR常见问题、原因分析及其解决方案
提高PCR反应特异性的策略
提高PCR反应特异性的策略
第二十五页，共31页。
巢式PCR（Nest-PCR）
四种策略
递减PCR（TouchDown PCR）
热启动PCR（HotStart PCR）
使用PCR增强剂
第二十六页，共31页。
策略之一
巢式PCR（Nest-PCR）
P1
P2
P3
P4
巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。
巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。
第二十七页，共31页。
策略之二
递减PCR（TouchDown PCR）
递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。
特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。
递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分