文档介绍：原创性声明本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名:趱曰期:丝丛一耻月Ⅱ日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文, 允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内容,可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》, 并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名:蛩旺导师签名:扯%_CJT_ILn 硕士学位论文摘要嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶的功能研究摘要:嗜酸硫化芽孢杆菌R%帕bacillus acidophilus TPY)是一株分离自太平洋热液口,中等嗜热嗜酸的革兰氏阳性菌,既能利用亚铁盐、单质硫自养生长,也能利用酵母粉、葡萄糖、蛋白胨和甘油等有机物异养生长。因此,TPY菌株对亚铁和单质硫的良好氧化能力显示出其在生物浸矿中的应用潜力。嗜酸硫化芽孢杆菌的硫氧化还原酶在有氧条件下催化单质硫反应生成亚硫酸盐、硫代硫酸盐和硫化氢。为研究硫氧化还原酶在硫氧化过程中的作用,克隆硫氧化还原酶基因,并表达纯化,复性得到有活性的硫氧化还原酶,经过亚***蓝比色法验证体外制各的硫氧化还原酶是有活性的。并凭借免疫共沉淀技术研究硫氧化还原酶的功能,挖掘出组氨酸蛋白激酶与硫氧化还原酶的关系密切。通过定点突变技术,发现嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶(SOR) 的活性位点(C3l、C101、C104、H86、H90、E114)与已报道的古菌及革兰氏阴性菌的相似,而六个活性位点突变蛋白的活性与已报道的古菌及革兰氏阴性菌的差别较大,这也正体现了这个来自于革兰氏阳性菌的硫氧化还原酶的特殊性。首先构建出可转移的表达载体pTre99A sot oriT,通过接合转移的方法,将所构建的载体成功转入了嗜酸硫化芽孢杆菌中,(pTrc99A sororiT),并对基因工程菌的硫氧化活性及理化参数进行了检测。实验结果表明,无论是以FeS04还是S为能源物质的培养基上,(pTrc99A soro胛1的硫氧化活性有一定程度的提高,这也充分说明,通过提高硫氧化途径的起始酶SOR的表达量, 可以提高嗜酸硫化芽孢杆菌的硫氧化活性。为了进一步探究基因工程菌硫氧化活性提高的原因,运用荧光定量PCR技术对基因工程菌中硫代谢相关基因的表达水平进行了研究。结果表明,在基因工程菌Sacidophilus(pTre99A soro胡)中,除了质粒上所携带的目的基因的表达水平有提高以外,硫代谢的其它相关基因的表达水平也有一定的变化。在FeSO。为能源物质的SA培养基上, (pTrc99A sotoriT)中,只有质粒上所携带的目的基因的表达水平提高了,其它硫代谢基因表达水平下调。在S为能源物质的SA培养基上,基因工程菌Sacidophilus(pTrc99A 硕士学位论文摘要中,除了质粒上所携带的目的基因的表达水平提高了,其它硫代谢基因表达水平也得到一定程度的提高,其中,以氧化亚硫酸根的APS 还原酶的表达量上调水平显著。关键词:硫氧化还原酶(SOR);定点突变;酶活;接合转移:基因工程菌;硫氧化活性分类号:Q933 Study on thefunction of sulfuroxygenase reductase from 鼽咖bacillus acidophilus TPY Abstract: Sulfobacillus acidophilus TPY is a gram-positive, thermoacidophilic bacterium iS01atedfromdeep-sea hydrothermal vent in can notonly grow autotrophic Withferrous sulfate or elemental sulfur,but alsogrow heterotrophic withyeastextract、glucose、 peptone or to itsgood oxidizingcapacity,Sulfobacillus acidophilus TPY shows the application poten