标记hrp简易过碘酸钠法.doc

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标记HRP——简易过碘酸钠法
1.　原理：
经典的过碘酸钠法中需采用二硝基***苯封闭HRP上残留的α-与ε氨基基以防止酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，从而省去了二硝基***苯封闭HRP步第 1 页
标记HRP——简易过碘酸钠法
1.　原理：
经典的过碘酸钠法中需采用二硝基***苯封闭HRP上残留的α-与ε氨基基以防止酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，从而省去了二硝基***苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH４(或乙醇***)复原生成稳定的酶标记抗体
试剂及器材
(1)　 NaIO４：称取241mg高碘酸钠溶于10ml蒸馏水中。
(2)　1mM :
 NaAc (
加蒸馏水至2,000ml。
(3)　 :
Na２CO３ 
NaHCO３ 
加蒸馏水至50ml
再用蒸馏水作20倍稀释，即成 。
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(4)　NaBH４溶液(4mg／ml):
临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。
(5)   PBS
〔6〕  饱与硫酸铵
操作步骤
(1)　称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
 NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)　将上述溶液装入透析袋中，对1mM ，4℃过夜。
(4)　加20μl  ，～，然后立即参加10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)　／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。
(6)　将上述液装入透析袋中，对  PBS透析，4℃过夜。
(7)　在搅拌下逐滴参加等体积饱与硫酸铵，置4℃1小时。
(8)　3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱与硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量 。
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(9)　将上述溶液装入透析袋中，对 ，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
结果判定
定量与克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。
　　　　　　　　　酶量(mg／ml)　　  IgG量(mg／ml) 　  酶量
克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4
　　　　　　　　40,000 　　　　　　160,000　　　   IgG量
操作步骤
〔1〕。
 NaIO４溶液，混匀，    4℃静置30分钟。
〔3〕，混匀， 静置30分钟。
〔4〕参加含5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋， 碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜。
〔5〕 mL 新配的5 mg/mL NaBH４液，混匀，再置4 ℃, 2h。
〔6〕在搅拌下逐滴参加等体积饱与硫酸铵，置4 ℃ 1h。
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〔7〕3000 r/min