文档介绍：PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳
刘琳 1131428 环境科学
一、实验目的
1．学****并掌握PCR扩增的根本原理与实验技术。
2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。
二、实验原理
1. PCR扩增
.2 分别向9个薄壁管中分别参加24 ul的反响体系，并分别添加8种不同的模版，并于第9个薄壁管中参加无菌ddH2O作为阴性对照。
将薄壁管放入PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要到达30~40次。程序如下：
预变性： 94℃ 3min
循环： 94℃ 变性30s
55℃ 退火30s
72℃ 延伸30s
末次延伸：72℃ 5min
PCR扩增完成后，将样品取出并保存于15℃环境中。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验
，放到一锥形瓶中，×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀，待冷却至60℃左右，在胶液内参加适量的EB。
取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。
待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。
×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。取1μl缓冲液和5μl待测DNA样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。
接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。
观察溴酚兰的带〔蓝色〕的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。
在紫外***仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，翻开紫外灯，通过观察孔进行观察。
五、实验结果与讨论
如下图：从左至右，分别是模版1-8号，第9列为阴性对照。
前8列均有明显的条带出现，而阴性对照无显示，说明扩增整体效果很好。图中有上下两条线，上面一条线所覆盖的条带根本可以代表扩增的产生的片段位置，参照图可以看出扩增片段在200bp左右。在第9个阴性对照的第二条线处可以看到较为模糊的条带，并非是出现假阴性，而是由于二聚物而产生的条带。通过该条带与最右侧的marker比照可知该片段出现在100bp左右，并非由于实验操作等问题而产生的污染。
实验的照片显示实验结果有拖尾现象，但是并不影响后续实验。在实验过程中由于有些试剂加到了管壁上面，并没有完全参加，可能会出现一些误差。另外在第1列条带中出现了其他的亮带，可能是由于在前期的扩增实验中滴加试剂时由于量过少而进行的摇匀和融合等操作产生了非特异性扩增，也有可能是因为胶板制作过程中梳子的位置不适宜或者胶板制作时边缘处不够均匀导致产生污染。但总体而言，实验结果较为满意。
六、实验考前须知
，可使一个DNA分子得以扩增，装有PCR试剂的离心管翻开之前，应先在微量离心机上作瞬间离心使液体沉积于管底。PCR扩增反响的条件，要控制好温度、时间和循环次数。
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