第十九章 在基因水平诊断疾病.doc

文档介绍：第十九章在基因水平诊断疾病
基因诊断(gene diagnosis)的概念:
利用分子生物学技术,从DNA或RNA 水平检测基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态,从而对疾病作出诊断。
目标序列的识别和定性定量分析是基因诊断的基础
基因诊断经历了三个基本发展阶段:
第一阶段:20世纪80年代,以DNA分子杂交为基础,通过限制性片段长度多态性性(RFLP)分析进行.
第二阶段:应用PCR技术.
第三阶段:应用基因芯片技术

(一) 核酸杂交( Molecular Hybridization )
(1)利用具有一定互补序列的两种核酸单链(探针和目标)在液相或固相体系中可缔合成异质双链的原理,用以分析被测样品中特定目标序列的方法。
(2)几种不同形式的核酸分子杂交
a. Southern印迹(southern blot)杂交: 用于DNA的检测,可用于基因的限制性内切酶谱分析,基因突变分析等.
b. Northern印迹(Northern blot)杂交: 用于RNA的检测,能对组织细胞中的总RNA 或mRNA进行定性和定量分析.
c. 斑点杂交(dot blot): 既可以检测DNA也可以检测RNA,、灵敏;但特异性低.
(in situ hybridization): ,用于检测染色体中特定的基因位置,用于染色体疾病的诊断.
(二)PCR技术在基因诊断中的应用
(1)等位基因特异性寡聚核苷酸(allele specific oligonnucleotide,ASO)探针斑点杂交: PCR-ASO
(2)单链构象多态性(single strand conformation ploymorphism,SSCP)分析
,在中性条件下长度相同的单链指DNA,如果碱基组成和(或)排列顺序不同,形成的构象就不同,.
(3)限制性片段长度多态性( restriction fragment length polymorphisms,RFLP)分析
基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失. 用限制酶对不同个体基因组进行消化时,其电泳条带的数目和大小就会产生改变,根据这些改变可以判断出突变是否存在.
(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术
双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而解链,, DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性,DNA开始解链,从而不同的DNA片段会形成不同的迁移率条带.
(5)用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR)进行分析
(6)采用PCR技术对靶核酸进行定量分析
a. 通过测定PCR产物量

b. 采用极限稀释法对靶核酸进行定量分析:

d. 采用竞