文档介绍：关于实验七酵母醇脱氢酶的提纯
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1、实验目的
学习和掌握目的物质的提纯
掌握酵母醇脱氢酶的提纯方法和原理
掌握酵母醇脱氢酶活力测定的方法
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2、实验重点和难点
6为佳。
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盐
大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度。所以，抽提液一般采用等渗溶液。—, NaCl等。焦磷酸钠和柠檬酸钠的缓冲液有助于切断酶和其他物质的联系,，少数情况下用水抽提亦佳,这可能与低渗破坏细胞结构有关.
温度
通常控制在0一4℃，可以例外。
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抽提液用量
常采用原料量的1—5倍。有时，为了抽提效果好些需要反复抽提。
浓缩
提取液或发酵液的酶蛋白浓度一般很低，％一1％。因此，在分离纯化过程中，酶溶液往往需要浓缩。浓缩的方法很多，如：盐析或溶剂沉淀法、超过滤法、离子交换树脂法等。这些方法既是浓缩的方法，又是分离纯化的手段。再如真空浓缩、冷冻浓缩法、蒸发法、凝胶吸水法、聚乙二醇吸水法等。
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酶和杂蛋白的性质差异大体上可有以下几个方面，：
(1)根据分子大小轻重设计的方法。如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。
(2)根据溶解度大小分离的方法、如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。
(3)按分子所带正负电荷多少分离的方法，如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。
(4)按稳定性差异建立的分离方法，如选择性热变性法表面变性法等。
(5)按亲和作用的差异建立的分离方法，如亲和层析法等.
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结晶是指分子通过氢键、离子键或分子间力按规则并且周期性排列的一种固体形式，由于各种分子间形成结晶的条件不同，也由于变性蛋白质和酶不能形成结晶，因此，结晶既是一种酶是否纯净的标志，又是一种酶和杂蛋白分离的方法。
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盐冰浴的降温原理与溶液的凝固点下降有关。当食盐和冰均匀地混合在一起时，冰因吸收环境热量稍有融化变成水，食盐遇水而溶解，使表面水形成了浓盐溶液。由于浓盐溶液的冰点较纯水低，而此时体系中为浓盐溶液和冰共存，因此体系的温度必须下降才能维持这一共存状态（浓盐溶液和冰的共存温度应该比纯水的冰点更低）。这将导致更多的冰融化变成水来稀释浓盐溶液，在融化过程中因大量吸热而使体系温度降低。
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低温冰盐浴配方：(碎冰用量100克) 浴温(℃) 盐类及用量(克) - CaCl2•6H2O(20g) - CaCl2•6H2O(41g) - CaCl2•6H2O(81g) - CaCl2•6H2O(124g) - CaCl2•6H2O(143g) - NaCl(33g) - NaNO3(50g)
- NH4Cl(20g)+NaCl(40g)
- NH4NO3(32g)+ NH4CNS(59g)
- NH4Cl(13g)+ NaNO3()
- KNO3(2g)+ KCNS(112g)
- NH4CNS()+NaNO3()
-40 NH4NO3(42g)+NaCl(42g)
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酵母醇脱氢酶
醇脱氢酶的辅酶NAD，能催化乙醇脱氢变成乙醛，脱下的氢则使NAD还原。
当有过量醇存在时，NAD+被还原的速度与酶活力成正比，酶活力越高，单位时间产生的NADH越多。NADH对340nm紫外线有强吸收，NAD+无此能力，因此可以测定A340nm的方法测得反应体系中NADH含量，从而得知酶活力的大小。
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4、操作步骤
1）粗提：20g酵母干粉中加入80mL Na2HPO4溶液中37℃水浴2h，室温放置3h，4000rpm冷冻离心20min;（目的是活化酵母，使其分泌酵母醇脱氢酶，并提取醇脱氢酶到溶液中）
2) 热变