文档介绍：1、实验目的学习和掌握目的物质的提纯掌握酵母醇脱氢酶的提纯方法和原理掌握酵母醇脱氢酶活力测定的方法2、、实验原理酶是一类由活细胞产生的,对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质。蛋白质部分:酶蛋白(apoenzyme)辅助因子(cofactor)金属离子小分子有机化合物全酶(holoenzyme)酶蛋白决定反应的特异性辅助因子决定反应的种类与性质金属离子的作用稳定酶的构象;参与催化反应,传递电子;在酶与底物间起桥梁作用;中和阴离子,降低反应中的静电斥力等。小分子有机化合物的作用在反应中起运载体的作用,传递电子、质子或其它基团。NAD+尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸,辅酶I当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加,达最大速度;反应为零级反应。酶活力(EnzymeActivity)也称酶活性,是指酶催化一定化学反应的能力。酶活性是研究酶的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。酶活力是用在一定条件下,它所催化某一反应的反应初速度来表示。酶反应速度(指初速度)。比活力(性)(SpecificActivity)是酶纯度的量度,即指:单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数,一般用IU/mg蛋白质来表示。一般来说,酶的比活力越高,,因此,一般可用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液抽提酶。抽提液的具体组成和抽提条件的选择,取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其他物质的连结。选用pH,首先考虑酶的稳定性。选用pH不应超过酶的pH稳定范围。其次,从抽提效果出发,最好远离待抽提酶的等电点。也就是说,酸性蛋白宜用碱性溶液抽提;碱性蛋白宜用酸性溶液抽提。第三,在某些情况下,抽提还兼有切断酶与细胞内其它成分间可能有的联系,从这点出发,选用pH4—6为佳。盐大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度。所以,抽提液一般采用等渗溶液。—,。焦磷酸钠和柠檬酸钠的缓冲液有助于切断酶和其他物质的联系,,少数情况下用水抽提亦佳,℃,可以例外。抽提液用量常采用原料量的1—5倍。有时,为了抽提效果好些需要反复抽提。浓缩提取液或发酵液的酶蛋白浓度一般很低,%一1%。因此,在分离纯化过程中,酶溶液往往需要浓缩。浓缩的方法很多,如:盐析或溶剂沉淀法、超过滤法、离子交换树脂法等。这些方法既是浓缩的方法,又是分离纯化的手段。再如真空浓缩、冷冻浓缩法、蒸发法、凝胶吸水法、聚乙二醇吸水法等。酶和杂蛋白的性质差异大体上可有以下几个方面,:(1)根据分子大小轻重设计的方法。如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。(2)根据溶解度大小分离的方法、如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。(3)按分子所带正负电荷多少分离的方法,如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。(4)按稳定性差异建立的分离方法,如选择性热变性法表面变性法等。(5)按亲和作用的差异建立的分离方法,如亲和层析法等.