文档介绍：实验七 酵母醇脱氢酶的提纯
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1、实验目的
学习和掌握目的物质的提纯
掌握酵母醇脱氢酶的提纯方法和原理
掌握酵母醇脱氢酶活力测定的方法
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2、实验重点和难点
实验原理
酶活及用量(克) - CaCl2•6H2O(20g) - CaCl2•6H2O(41g) - CaCl2•6H2O(81g) - CaCl2•6H2O(124g) - CaCl2•6H2O(143g) - NaCl(33g) - NaNO3(50g)
- NH4Cl(20g)+NaCl(40g)
- NH4NO3(32g)+ NH4CNS(59g)
- NH4Cl(13g)+ NaNO3()
- KNO3(2g)+ KCNS(112g)
- NH4CNS()+NaNO3()
-40 NH4NO3(42g)+NaCl(42g)
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酵母醇脱氢酶
醇脱氢酶的辅酶NAD，能催化乙醇脱氢变成乙醛，脱下的氢则使NAD还原。
当有过量醇存在时，NAD+被还原的速度与酶活力成正比，酶活力越高，单位时间产生的NADH越多。NADH对340nm紫外线有强吸收，NAD+无此能力，因此可以测定A340nm的方法测得反应体系中NADH含量，从而得知酶活力的大小。
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4、操作步骤
1）粗提：20g酵母干粉中加入80mL Na2HPO4溶液中37℃水浴2h，室温放置3h，4000rpm冷冻离心20min;（目的是活化酵母，使其分泌酵母醇脱氢酶，并提取醇脱氢酶到溶液中）
2) 热变性沉淀杂蛋白：每组取上清液20ml，留取2mL到试管①中（冰浴），其余的放置于55℃水浴20min，迅速冷却；4000rpm冷冻离心20min；（目的是去除热敏感性蛋白质）
3）有机溶剂沉淀杂蛋白：取上清液，留取2mL到试管②中（冰浴），其余的量体积后，，混匀，静止5min，4000rpm冷冻离心20min；（目的去除杂蛋白）
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4）有机溶剂沉淀酵母醇脱氢酶：取上清液，留取2mL到试管③中（冰浴），其余的量体积后，，沉淀完全后，4000rpm冷冻离心20min；（目的是沉淀酵母醇脱氢酶）
5）弃上清，加入5ml水溶解沉淀，置于试管④中（冰浴）；
6）将每一步获得的溶液进行适当稀释，测定酶活（利用催化醇脱氢的方法）和蛋白质浓度（利用考马斯亮蓝法）；目的是确定每一步的纯化效果。
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测定蛋白质浓度：从试管①②③④，%NaCl定容至20ml，置于试管①’②’③’④’中。
试管
0
①’
②’
③’
④’
样液（ml）
0
1
1
1
1
%NaCl（ml）
1
0
0
0
0
考马斯亮蓝（ml）
4
4
4
4
4
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测定酶活力：
将试管①②③④按以下比例稀释：
①1ml＋4ml K2HPO4
② ＋ K2HPO4
③ ＋ K2HPO4
④ ＋ K2HPO4
，3M乙醇 ， NAD ，蒸馏水 ，稀释的样液 1ml（对照液中加蒸馏水）。
每隔15s测一次A340，直至不变。
。
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5、作业
原始数据：记录每次纯化所得溶液体积，测定蛋白质浓度的OD值，测定酶活力的OD值变化情况。
实验报告：
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提纯步骤
总体积
/ml
A
蛋白质浓度
/(mg/ml)
B
蛋白质总量
/mg
C
酶活力
/U
D
总活力
/U
E
比活力
/(U/mg)
F
回收率（%）
蛋白质
G
酶活力
H