文档介绍：2-PCR基因扩增及扩增产物的回收
The user can demonstrate on a projector or computer print the presentation and make it into e used in 3’
GACGG 5’
T
发卡结构
引物的碱基组成：
引物内部不能形成二级结构：
尽可能随机分布，G+C含量 45-55%。
两个引物间不能有两个以上连续碱基互补序列
避免形成引物二聚体（dimer）
5’GGTCTGCCAGTCTAC3’
3’CAGGACTTAGTCACT5’
primer1
primer2
引物设计现在多用专业软件
， DNA database等
Tm=（G+C)4 + (A+T)2Tm= +(lg[K+])+(%[G+C])-675/n
适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。
一般估计：当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55℃ 。
引物的Tm值: 实际复性温度选择低于Tm值5℃
引物的浓度: mol/L
模板的量：不能太多，100l反应体系中约100ng
纯度： PCR对模板DNA的纯度要求不高，但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。
3. 模板（template)
dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称，，浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率
4. dNTPs
Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）， -。
5. Mg2+ 的浓度
PCR反应的条件优化
变性温度和时间：92-95℃，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失；
退火温度与时间：引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高，通常37-55℃、1-2分钟；
延伸温度和时间：72℃，接近Taq酶的最适75℃；延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间；
循环次数：循环过多，非特异性产物大量增加
关于本次实验
大肠杆菌K12碱性磷酸酶基因序列（CDS，）
551 aagttgtcac ggccgagact tatagtcgct ttgtttttat tttttaatgt
601 atttgtacat ggagaaaata aagtgaaaca aagcactatt gcactggcac
651 tcttaccgtt actgtttacc cctgtgacaa aagcccggac accagaaatg
701 cctgttctgg aaaaccgggc tgctcagggc gatattactg cacccggcgg
751 tgctcgccgt ttaacgggtg atcagactgc cgctctgcgt gattctctta
801 gcgataaacc tgcaaaaaat attattttgc tgattggcga tgggatgggg
851 gactcggaaa ttactgccgc acgtaattat gccgaaggtg cgggcggctt
901 ttttaaaggt atagatgcct taccgcttac cgggcaatac actcactatg
951 cgctgaataa aaaaaccggc aaaccggact acgtcaccga ctcggctgca
1001 tcagcaaccg cctggtcaac cggtgtcaaa acctataacg gcgcgctggg
1051 cgtcgatatt cacgaaaaag atcacccaac gattctggaa atggcaaaag
1101 ccgcaggtct ggcgaccggt aacgtttcta ccgcagagtt gcaggatgcc
1151 acgcccgctg cgctggtggc acatgtgacc tcgcgcaaat gctacggtcc
1201 gagcgcgacc agtgaaaaat gtccgggtaa cgctctggaa aaaggcggaa
1251 aaggatcgat taccgaa