文档介绍：Chapter 10
分子生物学常用技术
一、核酸提取
1、核酸的分类及分布
脱氧核糖核酸 90%以上分布于细胞核,其余分布于
(deoxyribonucleic acid, 核外如线粒体,叶绿体,质粒等。
DNA)
携带遗传信息,决定细胞和个
体的基因型(genotype)。
核糖核酸分布于胞核、胞液。
(ribonucleic acid, RNA)
参与细胞内DNA遗传信息的表达。
某些病毒RNA也可作为遗传信息
的载体。
2、核酸的理化性质
◆晶形
DNA为白色纤维状固体
RNA为白色粉末状固体
◆两性解离
呈酸性
在中性溶液中带负电荷
◆溶解性
均溶于水
不溶于一般有机溶剂,在70%乙醇中形成沉淀
Nacl 1-2M Nacl
DNA-蛋白溶解度低溶解度高
RNA-蛋白溶解度高溶解度低
◆DNA和RNA对酸或碱的耐受程度
DNA耐弱碱
◆酶水解
DNA水解酶(DNase):以DNA为底物,,需要Mg2+
RNA水解酶(RNase):以RNA为底物,不需要任何辅助因子
3、DNA的提取
◆原则
保证结构的相应完整性(避免高温和机械张力)
尽量排除其它大分子成分的污染
不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子
◆过程
破膜:SDS
去除蛋白质:蛋白酶K降解,SDS或其他变性剂(有
机溶剂),盐析等
去除 RNA:RNAase或浓盐
沉淀 DNA:乙醇沉淀
溶解 DNA:水或TE
◆影响因素:
物理因素:机械张力和高温
化学因素:过酸或过碱
DNAase : EDTA
灭活残余的DNAase
◆注意事项:
所有用品均需要高温高压
所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制
pH要准确()
动作要轻柔
避免过多的溶液转移
避免过高的温度
◆取动物组织100mg左右于样品管中,用干净的剪刀将组织块剪碎。
◆在样品管中加入500µl TE ()溶液,25µl 蛋白酶 K(10mg/
ml),75µl 10% SDS,5µlRNAase(1mg/ml)
◆混匀后置56℃下消化2 小时以上(隔一定时间混匀一次)。
◆加入等体积的饱和酚()溶液,轻轻颠倒混合10分钟
◆12000 r/min 离心10分钟。
◆小心将上层清液移至另一干净的离心管中,加入等体积的苯酚/
氯仿/异戊醇(25:24:1),轻轻颠倒混合10分钟。
◆ 12000r/min 离心10分钟。
◆小心将上层清液移至另一干净的离心管中以等体积的/氯仿/异戊
醇(24:1),轻轻颠倒混合10分钟。
◆小心将上层清液移至另一干净的离心管,加2倍体积的冷无水乙
醇。
◆12000r/min 离心10 分钟,弃上清。
◆再以70%冷乙醇洗涤DNA 沉淀一次。
◆将沉淀置真空干燥器或37℃温箱中干燥。
人全血DNA的提取
红细胞裂解液组成: NH4Cl; Tris碱溶于1L dH2O,
核裂解缓冲液组成:10mMTris(),400mMNaCl,2mM EDTA
◆取适当体积抗凝血,加入2倍体积红细胞裂解液,涡旋涡30秒;
◆10000-20000rpm离心1分钟,弃红色上清;
◆加入3倍于全血体积的红细胞裂解液,涡旋重沉淀;
◆10000-12000rpm离心30秒,弃红色上清,重复操作至沉淀为白色;
◆加入200μl核裂解液和50 μl 10%SDS,用枪头搅散沉淀;
◆加入150μl核裂解液、10ul 20mg/ml proteinase K,混匀;
◆65℃水浴2小时以上或50℃消化过夜;
◆加入1/ M NaCl高速离心(12000rpm)离心10分钟;
◆转移上清至新离心管;
◆加入2倍体积预冷的无水乙醇,颠倒混匀(可见絮状沉淀);
◆高速离心(12000rpm)15分种,弃上清;
◆75%乙醇洗涤沉淀,高速离心(12000rpm)5分种,弃上清;
◆室温凉干,×TE溶解沉淀;-20℃储存;
44 总总RNARNA的提取的提取
◆关键点
样品细胞或组织的有效破碎
有效地使核蛋白复合体变性
对内源和外源RNA酶的有效抑制
有效地将RNA与DNA、蛋白分离
◆外源RNA酶的来源及有效抑制
玻璃制品,塑料制品:180 ℃ %焦
碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡
研究人员:勤换手套
溶液:用高压灭菌水和RNA研究专用的化学试剂配制或