文档介绍：第七章植物快速繁殖和脱毒
茎尖培养脱毒
植物脱毒（virus elimination）：利用
植物组织培养技术，脱除植物细胞中浸染
的病毒，生产健康的繁殖材料。
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认识病毒
◆ 特点
◆理时间三者之间的协调关系。
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①并非能脱除所有病毒。主要是利用某些病毒受热以后的不稳定性，而使病毒失去活性。
②延长处理时间，病毒钝化效果好，同时也会钝化植物组织的抗性因子而降低了处理效果。
③热处理后只有小部分植株能存活。
◆热处理方法主要缺陷
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(2) 化学方法
一些化学药品如嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素处理，可在某种程度上抑制植物体内或离体叶片内病毒的合成，但仍不能使病毒失治。但近年发现三氮唑核苷就可以使病毒失活。
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茎尖以外其他途径脱毒
(学生自学)
◆ 愈伤组织脱毒
◆ 珠心胚培养脱毒
◆ 茎尖微体嫁接脱毒
◆ 培育抗病毒栽培种
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脱毒苗的鉴定
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直接观察植株茎叶有无某种病毒引起的可见症状
直接鉴定法
感染CyMV(蕙兰嵌纹病毒)病毒的
蝴蝶兰叶片出现坏疽及凹陷的斑块
烟草马铃薯Y病毒病
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生物鉴定法（敏感植物鉴定法） indicator test plants
◆概念：有些植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在其叶片乃至全株上表现特有的病斑，把这种植物称为病毒敏感植物或指示植物。
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每种病毒都有自已的敏感植物
如：马铃薯病毒的敏感植物有千日红、黄花烟、毛叶曼陀罗；大蒜病毒的敏感植物有黎、千日红；大丽花病毒的敏感植物为：矮牵牛、黄瓜；菊花病毒：矮牵牛、豇豆 。
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从待测植物中取1－3g幼叶置于研钵中
磨成匀浆
吸取少量浆液擦抹指示植物叶片， 使浆液能浸入叶片表皮细胞
指示植物置于防蚜虫网罩的温室内
数周后观察
清水冲洗叶面
磷酸缓冲溶液
◆敏感植物鉴定病毒的方法
①摩擦
接种法
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②嫁接法
有些病毒不是通过汁液传播，而是通过专门的介体传播。如草莓黄化病毒、草毒丛枝病毒是通过一种特殊的蚜虫为介体进行传播。这种病毒的鉴定需将培养植株的芽嫁接在敏感植物上，根据敏感植物的病症表现来判断是否脱除了病毒。
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原理：
抗血清鉴定法 serologic test
当动物被病毒感染或人工注射异体蛋白质时
一种特异性丙种球蛋白称为免疫球蛋白
抗体在特殊细胞内形成，进入血液存在于血清和体液内。
这种含有特异性“抗体”的血清称为“抗血清”。
抗体
抗原
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如玻璃片凝集法：在清洁玻璃片的一端，用毛细管滴加5滴稀“抗血清”，另一端滴加等量对照血清。然后各加滴被检植物压榨出的原汁液两滴。用玻璃棒搅匀，在常温下静置20－50min，然后在40－60倍显微镜下观察。带病毒的叶绿体发生典型的凝集现象。
方法:
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① 具有高度的专化性。
② 可诊断受感染而没有症状的带毒植物。
③ 由于病毒与“抗血清”的“反应量”与病毒浓度成正比。
◆抗血清鉴定法优点
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①不是所有病毒都能制成抗血清，一般“黄化型”病毒，或严格由专化性昆虫传播的病毒。如马铃薯卷叶病毒极难或不能获得“抗血清”。
②病毒在寄主体内含量太少，而提纯过程中丧失又太多。或者提纯过程中，病毒质粒丧失了必备的抗原结构。
③植物体内具有单宁物质，单宁与病毒结合，使病毒丧失了抗原性质。
◆抗血清鉴定法缺点
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电子显微镜鉴定法
用电镜直接观察经脱毒培养的
叶片，检查是否有病毒质粒的
存在，还可以测量病毒颗粒的
大小、形状和结构。
透射电子显微镜
扫描电子显微镜
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常采用的方法为吐水法和浸蘸法。
吐水法是在清晨用网架上的薄膜沾一些病株
吐水孔的积水，染色后就可直接放到
电镜下镜检。
浸蘸法是在网架薄膜上加1滴重蒸馏水，将
病株叶片或幼芽的新鲜切口在水滴中
浸几秒钟，吸去多余水分，再进行染
色，然后放到电镜下观察。
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分子检测法
如RT-PCR（反转录PCR）法：将待测样品的总RNA与cDNA合成的试剂盒进行反应，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列设计引物进行PCR反应，即可知道在寄主中是否有病毒基因的存在及表达。
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PCR
琼脂糖凝胶电泳
最终产物
紫外光观察
3-4 小时
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脱毒后防病毒再感染
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无病毒苗的隔离保存
通常无病毒苗原种要在隔离区，如海岛