文档介绍：精氨酸激酶AK
1 透析
按照分子大小进行分离。分离取决于透析袋截留的分子量。
透析液
浓缩的蛋白混合样品
透析袋
开始透析
处于平衡状态
层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰***凝胶（polyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。
电泳技术分类
垂直板电泳
毛细管电泳
水平板电泳
电泳支持物
滤纸
凝胶
薄膜
圆盘电泳
SDS－PAGE测定相对分子质量
十二烷基磺酸钠
原态蛋白质
变性
？
磺酸基极性亲水
烷基亲油（蛋白质疏水区）
迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量
巯基乙醇破坏二硫键
研究背景
精氨酸激酶的简介
无脊椎动物的精氨酸激酶（Arginine kinase, AK）（ATP:N-）类似于脊椎动物中的肌酸激酶（creatine kinase ，CK）（ATP:N-），是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。AK在体内催化反应方程式如下：
主要实验仪器
紫外分光光度计U－4300，电脑恒温层析柜、 ORION pH计、
紫外检测仪、冷冻离心机、超声破壁仪、雪山制冰机、
超纯水机、低温恒温槽电泳仪、电子天平、振荡培养箱、
单人单面净化工作台、电热恒温鼓风干燥箱、高压灭菌锅
实验内容
1 活化菌种
取50 µL表达菌种接入6 mL的LB液体培养基（含有卡那青霉素，其工作浓度为50 µg/mL）中，于37 ℃摇床振荡培养8-12小时。
2 扩大培养
将试管中活化的3 mL菌液接种到100 mL LB培养基，同时加入卡那青霉素（终浓度50 µg/mL）培养基于37℃恒温培养箱中培养2-3 小时。
3 IPTG诱导AK的表达
实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入 IPTG诱导表达发现，当温度为22 ℃，OD=-， mM时AK的表达量达到最大。
4 蛋白质提取
（1）将上述各管于4 ℃，5000 r/m离心10分钟；
（2）弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g 沉淀加5 mL裂解液；
（3）在冰上进行10分钟，间隔为2秒钟的超声波破壁,直到沉淀变得澄清为止；
（4）于4 ℃，12000 rpm，离心10分钟，取上清，得到AK的粗提液。
5 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白
预处理：
(1)用2 M盐酸胍10 mL与树脂打散混合洗涤；
(2)用Stripping Buffer洗20分钟；蒸馏水洗30分钟；
(3) M盐酸胍洗30分钟，蒸馏水洗30分钟；
(4)用1 M NaOH洗1小时；用Binding Buffer洗20分钟；蒸馏水洗30分钟；
(5) M NaCl洗1小时；用Binding Buffer洗20分钟；蒸馏水洗30分钟；
(6)Ni柱再生：150 mL M NiSO4洗→蒸馏水洗（穿流液无色）→Binding Buffer平衡。
平衡：6倍柱床体积Binding Buffer（pH=）平衡。
上样：插A280滤光片，调A值（0）、T值（100）；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。将粗提液45 mL上柱，- mL/min。

洗脱：上样完后，继续用Binding Buffer （pH=）淋洗。待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（20 mM、40 mM、80 mM、100 mM、150 mM）洗脱。在280 nm处进行连续紫外检测，根据微电脑记录仪显示曲线。分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。
6 AK的检测
SDS-PAGE电泳：
（1）安装双垂直板电泳槽；
（2）配12%的分离胶5 mL，浓缩胶3 mL；
（3）制样：取样品20 µL与样品缓冲液10 µL混合，100 ℃加热5分钟；
（4）上样：用微量注射器加样15-20 µL
（5）电泳：在凝胶上加40 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部；
（6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；
（7