文档介绍：浆细胞肿瘤1
一. 概述
(一) 发展历史
1971年 Faulk和Taylon 用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合, 制备成金标抗体, 检测细菌表面抗原的分布
1975年 Horisberger等把胶金100ul
按从低→高的浓度，将已稀释好的蛋白溶液，分别加入已编号的试管中，对照管只加不含蛋白的稀释液，混匀，静置5 ~ 10 min
各管分别加10%NaCl 10μl，混匀，静置2hr，观察结果
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胶体金(ml) 1 1 1 1 1 1 1
蛋白质(ug) 5 10 15 20 25 30 35
10%NaCl
结果判断: 对照管或加入蛋白量不足，胶体金出现由红变蓝的凝聚现象；加入蛋白质量达到或超过稳定量，则胶体金保持红色不变
2. 光电比色法
利用分光光度计测各管580nm的OD值, 然后以OD值为纵坐标, 蛋白质浓度为横坐标作一曲线, 取曲线最先与横轴相接近的那一点的蛋白质浓度, 即为最适稳定量.
(五）标记
1. 计算所需待标记蛋白质的总量
根据用以标记的胶体金溶液总体积及所测定的最适蛋白质稳定量，计算出所需待标记蛋白质的总量
2. 调节PH：根据所标记蛋白质的等电点来调节胶体金的 PH
常用几种蛋白质标记时胶体金的 PH
蛋白质 PH
抗体
SPA
过氧化物酶
低密度脂蛋白
3. 磁力搅拌下，逐滴加入蛋白质溶液，作用 5～15min
4. 继续磁力搅拌，加入5％牛血清白蛋白，使其终浓度为1％，搅拌10min；也可加3％聚乙二醇，％
（六）标记探针的纯化
纯化的目的
去除溶液中未标记的蛋白质，未充分稳定的胶体金，以及在标记过程中可能产生的各种聚合物
纯化的方法
超速离心法和凝胶过滤法
1. 超速离心法
速度快，适合大样品的制备
离心 1500 r min，20min 弃沉淀
超速离心 4℃ 1h 弃上清
沉淀用PBS或TBS缓冲液（％牛血清白蛋白重新悬浮至原体积的 1 10～1 20
离心 1500 r min，20min 弃沉淀
分装 4℃ 保存
2. 凝胶过滤法
将探针溶液装入透析袋内， 4℃ ，置于硅胶或聚乙二醇中浓缩至原体积的1 4～1 5
离心 1500 r min，20min 弃沉淀
经Sephacryl（丙烯葡聚糖）S400层析柱分离纯化。 TBS(%BSA)洗脱
TBS的PH根据蛋白质种类而定
按红色深浅分管收集洗脱液
(七) 标记探针的鉴定
1. 负染色检查: 将胶体金溶液滴在覆有Formavar膜(支持膜) 的镍网上, 空气中干燥, 醋酸铀负染, 透射电镜下观察
2. 生物活性鉴定: 可用直接或间接法放射免疫测定, 凝聚试验及免疫组化染色进行鉴定
四. 免疫胶体金染色方法
(一)免疫金染色法
Immunogold staining, IGS
【基本原理】
1. 直接法---将胶体金标记的一抗直接对标本进行染色,然后在光镜或电镜下观察
方法简单, 但一种探针仅限于检测一种抗原, 较局限
2. 间接法---先将未标记的特异性一抗与标本中的抗原结合, 然后加金标二抗或SPA与一抗结合, 在光镜或电镜下对抗原的分布进行定位研究
【特点】
1. 阳性部位显红色
2. 染色程序简便, 不需显色或显影过程
3. 但一般要求金颗粒的直径>20nm, 并要求用高浓度的免疫金溶液
(二) 免疫金银染色法
Immunogold silver staining, IGSS
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