文档介绍：PCR基因扩增
2022/5/1
作者:蒋华云
一、实验目的
通过本实验学****PCR反应的基本原理与实验技术
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作者:蒋华云
二、实验原理
PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法，
DNA strand
PCR Cycle 2
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作者:蒋华云
Two single strands
of correct length
PCR Cycle 2
End cycle 2
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作者:蒋华云
End cycle 3
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作者:蒋华云
End cycle 4
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作者:蒋华云
Following n cycles of PCR there will be No(1+Y)n copies
No initial number of targets
Y efficiency of PCR reaction
n cycle number
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作者:蒋华云
1、PCR反应中的主要成份
引物
dNTP
Mg2+
模板
Taq DNA聚合酶
反应缓冲液
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作者:蒋华云
引物
PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定
引物设计和选择目的DNA序列区域时遵循下列原则：
引物长度约为16～30bp
引物中G+C含量通常为40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估计引物的解链温度
四种碱基应随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发
引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对
在引物内，尤其在3’端应不存在二级结构
两引物之间尤其在3’端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量
引物5’端对扩增特异性影响不大，可引入酶切位点或突变位点
引物不与模板结合位点以外的序列互补
简并引物应选用简并程度低的密码子
～，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，引物浓度偏低则降低产量
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作者:蒋华云
dNTP
dNTP常用的浓度为20～200μmol/L，而且4种dNTP的终浓度相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足而出现的错误掺入
dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误掺入率，同时会抑制Taq DNA聚合酶的反应活性；适当的低浓度会提高反应的精确度
注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系
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作者:蒋华云
Mg2+
Mg2+浓度会影响Taq DNA聚合酶的活性、真实性，影响引物退火、解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等
通常Mg2+～2mmol/L
在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度
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作者:蒋华云
模板
PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，单链分子、双链分子、线状分子或环状分子均可以作为模板 DNA （线状分子比环状分子的扩增效果稍好）
模板的数量和纯度均会影响PCR结果：一般反应中的模板数量为102 ～105 个拷贝。模板拷贝数过多可能会增加非特异性产物
模板DNA中的杂质也会影响PCR的效率
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作者:蒋华云
Taq DNA聚合酶
早期PCR扩增是由大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段完成，但这种酶不耐热，所以每一轮循环在变性和退火后必须加入新酶
后来引入耐热的Taq DNA聚合酶，一般Taq ℃ 130min，95℃ 40min，97℃ 5min，因此PCR中变性温度不宜超过95 ℃
Taq DNA聚合酶的最适温度是72 ℃，连续保温30min仍具有相当的活性，一次加酶可满足PCR反应全过程的需要
纯化的Taq DNA聚合酶有5’→3’外切酶活性，而无3’→5’外切酶活性，不具有Klenow酶的3’→5’校对活性，因此在PCR中有错误掺入率，大约是每2×104个核苷酸中有一个，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤为注意
Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。在100μL反应体系中，～2U的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环
使用Taq DNA聚合酶浓度过高，可引起非特异性产物的扩增，浓度过低则扩增产物量减少
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作者:蒋华云
反应缓冲液
一般含100mmol/L Tris·Cl （20℃-）, 500mmol/L KCl和0. 1％的明胶，有时候还有适当浓度的Mg2+
Tris·Cl是一种双极性离子缓冲液，主要靠其调节pH，使Ta