文档介绍：目的基因 PCR 扩增产物的克隆[ 实验原理] 产物回收在高离子盐存在的情况下, DNA 片断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上,再通过一系列快速的漂洗、离心的步骤去蛋白液和漂选液,将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除,最后用低盐, 高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净 DNA 从硅基质膜上洗脱。载体与 PCR 产物的连接源 DNA 与载体分子的连接就是 DNA 重组, 这样重新组合的 DNA 叫做重组体或重组子。重组的 DNA 分子是在 DNA 连接酶的作用下,有 Mg2+ 、 ATP 存在的连接缓冲系统中, 将分别经酶切的载体分子与外源 DNA 分子进行连接。 DNA 连接酶有两种: T4 噬菌体 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。两种 DNA 连接酶都有将两个带有相同粘性末端的 DNA 分子连在一起的功能,而且 T4 噬菌体 DN A 连接酶还有一种大肠杆菌 DN A 连接酶没有的特性, 即能使两个平末端的双链 DN A 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低,一般可通过提高 T4 噬菌体 DNA 连接酶浓度或增加 DNA 浓度来提高平末端的连接效率。 T4 噬菌体 DNA 连接酶催化 DNA 连接反应分为3步: 首先, T4 DNA 连接酶与辅因子 ATP 形成酶-ATP 复合物; 然后,酶-ATP 复合物再结合到具有 5’磷酸基和 3’羟基切口的 DNA 上,使 DNA 腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为 DNA 片断有两个端点,所以切割时出现两种可能,一种是单酶切,另一种是双酶切,这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说, 载体与供体的末端都相同, 连接可以在任何末端之间进行, 这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底, 可对载体进行 5’除磷酸处理, 原理是连接酶只能连接 DN A 片断的 3’ OH 末端与 5’端,所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时,由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自身成环造成的高本底。对于双酶切来说, 无论载体与供体同一片段上都有不同的末端, 这样就避免了载体与供体的自环, 能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。连接反应的温度在 37 ℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度,即 12-16 ℃,连接 12-16h (过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。 Taq DNA 酶扩增的 PCR 产物,其 DNA 双链前后末端都有一个游离的 A 碱基,可以与 T -Vector 末端游离的 T 碱基互补形成环状重组 T 质粒。[ 实验材料、试剂和仪器] PCR 扩增相关试剂、 PCR 仪、移液枪、低温离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、 PCR 产物回收试剂盒、 pUCm-T 载体。[ 实验步骤]1. PCR 扩增 PCR 反应体系: 注:每组做 5 管,其中 4 管用于 PCR 产物回收, 1 管作电泳检测时的对照 PCR 反应程序: 10 × PCR Buffer μl dNTPs μl Taq μl 引物 1