文档介绍：三七总皂甙代谢工程三七总皂苷( Panax notoginseng saponins, PNS) 迄今已从三七的根块、根茎、茎叶和花果等各部位分离和鉴定出 70 余种皂苷, 均属于达玛烷型四环三萜皂苷, 按其皂苷元类型又可细分为 2 种: 1. 20( S) - 原人参二醇型[ 20( S) - protopanaxadiol ] 2. 20( S) - 原人参三醇型[ 20( S) – protopana-xatriol ]次级代谢通路? D- 葡萄糖–(糖酵解途径)乙酰辅酶 A(乙酸途径, krebs 循环) –(磷酸戊糖途径) 4-磷酸赤藓糖–莽草酸(莽草酸途径) –甲羟戊酸(甲羟戊酸途径, MVA 途径) – 5-磷酸-1- 脱氧木糖(磷酸脱氧木糖途径, MEP 途径) –氨基酸类–… PNS 生物合成途径 ( IPP ) & 二***烯丙基焦磷酸酯( DMAPP ) 的合成(均为萜类活性单位,可相互转化) 2. IPP 和 DMAPP 通过异戊烯基转移酶和萜类环化酶的催化合成合成 2,3- 氧化鲨烯( 2,3-Oxido saqualene ) , 3- 氧化鲨烯依次经过环化、羟基化、糖基化修饰, 最终形成达玛烷型三七皂苷达玛烯二醇合成酶( DS ) ?达玛烯二醇合成酶( Dammarenediol- Ⅱ-synthase , DS) 是氧化鲨烯环氧酶中的一种, 催化 2,3- 氧化鲨烯环化为达玛烯二醇。?PNS 属于达玛烷型四环三萜皂苷, ? DS 广泛存在于具有达玛烷型三萜生物合成功能的植物和微生物中, 已从人参( Panax ginseng ) , 积雪草( Centella asiatica ) , 粗茎鳞毛蕨( Dryopteriscrassirhizoma ) 等植物中克隆得到编码 DS 的基因?人参 DS 基因克隆与酵母表达( 2006 ) ?人参 DS 基因 RNAi (2006) 环阿屯醇合成酶(CAS) ?环阿屯醇合成酶(Cycloartenol synthase , CAS) 属于氧化鲨烯环氧酶的一种, 催化 2,3 -氧化鲨烯环化生成环阿屯醇?尽管 CAS 不是三萜皂苷生物合成途径中的关键酶, 但它是植物甾醇生物合成这个重要分支代谢途径中的关键酶, 与 DS 竞争共同前体 2,3- 氧化鲨烯, 间接影响了三萜皂苷代谢流。?已从盾叶薯蓣( Dioscorea zingiberensis ) ,豌豆( Pisum sativum ) ,红海榄( Rhizop horastylosa )和秋茄( Kandelia candel )中克隆得到 CAS 基因?红海榄和秋茄 CAS 酵母表达( 2007 ) ?人参 CAS 反义抑制(2009) ?拟南芥 CAS 等位基因突变( 2008 ) P450 单加氧酶和糖基转移酶( P450 ) ? P450 单加氧酶是一类具有多种催化功能以铁卟啉为辅基的膜结合蛋白, 可以催化许多初级和次级代谢反应。?在三萜皂苷的合成中, P450 单加氧酶不仅能催化达玛烯二醇生成原人参二醇, 还可以使原人参二醇转化为原人参三醇. ?目前, 糖基转移酶只在少数几种植物中被克隆,其中参与三萜皂苷合成的转移酶仅在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula )(2005) ,王不留行(Saponaria aria )(2006) 等植物中进行了研究。代谢工程策略 1)上调 DS 的表达,促进达玛烯二醇的合成 2)下调 CAS 的表达,减少旁支代谢通路 3)增强乙酸途径, MVA 途径和 MEP 途径中限速酶表达,增加次生代谢的基础水平。 4)探索参与三醇合成的 P450 酶基因附录:人参 DS 基因?.gov/ore/115334601 ? Panax ginseng PNA mRNA for dammarenediol -II synthase ? 2310bp ,编码 769aa 的 PNA 酶 MWKQKGAQGNDPYLYSTNNFVGRQYWEFQPDAGTPEEREEVEKARKDYVNNKKLHGI HPCSDMLMRRQLIKESGIDLLSIPPLRLDENEQVNYDAVTTAVKKALRLNRAIQAHDGHW PAENAGSLLYTPPLIIALYISGTIDTILTKQHKKELIRFVYNHQNEDGGWGSYIEGHSTMIG SVLSYVMLRLLGEGLAESDDGNGAVERGRKWILDHGGAAGIPSWGKTYLAVLGVYEWE GCNPLPPEFWLFPSSFPFHPAKMWIY