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PCR 扩增及 DNA 琼脂糖凝胶电泳
刘琳 1131428 环境科学
一、试验目的
学****并把握PCR 扩增的基本原理与试验技术。
对扩增后的DNA 进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。二、试验原 534、 ul Taq、 ddH2O 的比例配置足量的PCR 反应体系。
分别向 9 个薄壁管中分别加入 24 ul 的反应体系，并分别添加8 种不同的模版，并于第
9 个薄壁管中加入无菌ddH2O 作为阴性对比。
将薄壁管放入 PCR 扩增仪中，依据预定程序进行 PCR 扩增。其中循环过程需要达到
30~40 次。程序如下：
预变性： 94℃ 3min
循环： 94℃ 变性 30s
55℃ 退火 30s
72℃ 延长 30s
末次延长：72℃ 5min
PCR 扩增完成后，将样品取出并保存于15℃环境中。
DNA 琼脂糖凝胶电泳试验
称取琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，×TBE 电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透亮。摇匀，待冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的EB。
取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至 60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。
待胶凝固后，当心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。
在槽内加入 ×TBE 电泳缓冲液，至液面掩盖过胶面。取 1μl 缓冲液和 5μl 待测 DNA
样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。
接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调整稳压输出，电压最高不超过 5V/cm，开头电泳。点样端放阴极端。依据阅历调整电压使分带清楚。
观看溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm 处，可停止电泳。
在紫外***仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯，通过观看孔进行观看。
五、试验结果与争辩
如图所示：从左至右，分别是模版
1-8 号，第 9 列为阴性对比。
前 8 列均有明显的条带消灭，而阴性对比无显示，说明扩增整体效果很好。图中有上下两条线，上面一条线所掩盖的条带基本可以代表扩增的产生的片段位置，参照图可以看出扩增片段在 200bp 左右。在第 9 个阴性对比的其次条线处可以看到较为模糊的条带，并非是消灭假阴性，而是由于二聚物而产生的条带。通过该条带与最右侧的marker 对比可知该片段消灭在100bp 左右，并非由于试验操作等问题而产生的污染。
试验的照片显示试验结果有拖尾现象，但是并不影响后续试验。在试验过程中由于有些试剂加到了管壁上面，
并没有完全加入，可能会消灭一些误差。另外在第 1 列条带中消灭了其他的亮带，可能是由于在前期的扩增试验中滴加试剂时由于量过少而进行的摇匀和融合等操作产生了非特异性扩增，也有可能是由于胶板制作过程中梳子的位置不合适或者胶板制作时边缘处不够均匀导致产生污染。但总体而言，试验结果较为满足。
六、试验留意事项
由于PCR 技术格外敏感，可使一个DNA 分子得以扩增，装有PCR 试剂的离