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文档介绍：一种适配子及其筛选方法和应用的制作方法
一种适配子及其筛选方法和应用的制作方法
本发明提供了一组能识别KIAA0157蛋白的寡核苷酸序列及其制备方法。寡核苷酸序列包括SEQ?ID?～11，其分别具有较高的亲和特异性，可以用于KIGCT TCG CCG TCT CCTTC——
[0017]N35——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 为 35 个随机寡核苷酸；
[0018]引物Pl:TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC ；
[0019]引物P2:CCCTCTGGGGTCTCCCTCTTGTGC。
[0020]、适配子的SELEX筛选，具体方法如下:
[0021]、分离，具体方法如下:
[0022]取100μΜ的ssDNA寡核苷酸文库4μ L，用2X结合缓冲液稀释至100 μ 1，95 °C变性5min,冰浴IOmin后加入100 μ 1ΚΙΑΑ0157蛋白，摇床结合30min,再6000rpm离心5min,弃上清，然后用IX结合缓冲液洗沉淀，弃上清；在沉淀中再加入IX结合缓冲液100 μ L，96°C加热5min,然后15000rpm离心10min,取上清液,对沉淀再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与KIAA0157蛋白有亲和力的ssDNA次级文库；所述2X结合缓冲液为20X结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述IX结合缓冲液为20X结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20X结合缓冲液配方为IM NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HCl,IOmM MgC12、。
[0023]、分离，具体方法如下:
[0024]，再与100 μ 1ΚΙΑΑ0157蛋白摇床结合30min，，则可分离到与KIAA0157蛋白都有亲和力的ssDNA次级文库。
[0025]，具体方法如下:
[0026]，总体积为25 μ I的不对称 PCR 扩增体系为:10XPCR 缓冲液:2μ I ；Ρ1(10μΜ):1μ I ；Ρ2():1μ I ；dNTP (各 ): μ I ；MgCl2(25mM): μ I ;ssDNA 模板( μ g/μ I):2μ I ；Taq DNA聚合酶(5ιι/μ I): I ；ddH20: I ;PCR 反应参数:94°C预变性 4min，然后进行 40个循环94°C变性30s，58。。退火30s，72。。延伸20s，最后72°C延伸7min ；
[0027]，具体方法如下:
[0028]:用带有地高辛标记的引物Pl不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA次级文库，；
[0029]: L，95°C变性5mi