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荧光染料根底知识大全
**纺织染整团队今天
荧光显微镜技术的根本原理是借助荧光剂让细胞成分呈现高度具体的可视化效果，比方在目的蛋白后面连一个通用的荧光蛋白—GFP。fe Technologies旗下子公司，注：2014年2月Life Technologies被Thermo Fisher收购〕的商标。此外，这些产品标识中也涵盖了相应的激光激发波长。
例如，应用范围很广且最大激发波长为 493 nm的Ale*a Fluor®488，可由标准的488 nm激光激发。Ale*a Fluor®488的最大发射波长为 519 nm，正是因为具备上述特性，使得 Ale*a Fluor®488与 FITC 的属性相似。
尽管 Ale*a Fluor®488是一种荧光素衍生物，但与 FITC 相反，它拥有更佳的稳定性和荧光亮度，且 pH 敏感度也更低。所有 Ale*a Fluor® 染料〔比方，Ale*a Fluor®546、Ale*a Fluor®633〕都是不同根底荧光物质的磺化形式，例如，荧光素、香豆素、青色素或罗丹明，它们的摩尔质量在410 至 1400 g/mol 范围之内。
图 2：小鼠转基因胚胎、肢间体节，小鼠转基因胚胎的 5 个肢间体节：Epa*ialMyf5 eGFP；GFP-Ale*a 488 免疫组化染色；用 Desmin-Cy3 对胚胎肌肉纤维进展染色，用 Hoechst Size 自上而下提醒细胞核： mm (a)，800 µm (b)。图片来源：Aurélie Jory, CellulesSouches et Développement, Institut Pasteur, Paris,France and Imaging centre of IGBMC, IGBMC。
图 3：小鼠成纤维细胞，绿色：F-Actin，FITC；红色：Tubulin，Cy5；蓝色：细胞核，DAPI。图片来源：德国·海德尔堡·马克斯-普朗克研究所·Günter Giese博士
5DNA 染色
在荧光显微镜技术中，不只研究蛋白构造，核酸同样具有重要的研究意义。有时候，必须通过检测细胞核来确定细胞的准确位置及其数量。最常用的一种DNA 染色剂当属 DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚) ，其可与DNA 双螺旋的 A-T 富集区域相结合。如果 DAPI 附着到 DNA 上，其荧光强度将比游离状态要高。该染色剂受最大波长为358 nm的紫外光激发，其发射光谱非常宽，在461 nm 处到达峰值。此外，还可对弱荧光进展 RNA 结合检测。在这种情况下，发射波长将转移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能够穿透整个细胞膜。因此，它可以用于固定和活细胞之中。
第二种被广泛使用的DNA 染色剂就是 Hoechst 染料系列，这些染料原先都是由 Hoechst AG 这家化学公司生产的。Hoechst 33258、Hoechst 33342以及Hoechst 34580 均为双苯酰亚***，可嵌入 A-T 富集区域，因此，该系列染料很少用到。与 DAPI 相似，这三种染色剂都可受最大发射波长为455 nm的紫外光激发，而未被结合的染色剂，其最大发射波长在 510–540 nm 之间。Hoechst 染色剂还具有细胞渗透性，因此可用于活细胞或已固定的细胞中。该染色剂与DAPI 的不同之处在于，它们的毒性较低。
碘化丙啶〔Propidium-Iodide，PI〕是一种不能透过细胞膜的 DNA 染色剂。由于具备上述特性，该染色剂无法进入完整的细胞中，因此，该染色剂常用于区分细胞群中的活细胞和死细胞。此外，碘化丙啶还是一种嵌入剂，但对于不同的碱基并不存在结合的差异性。该染色剂与核酸结合后，最大激发波长为538 nm，最大发射波长为 617 nm。未结合 PI 的最大激发和发射波长和光强会更低一些。PI 还可结合 RNA，同时无需改变自身的荧光特性。有时候为了区分DNA 和 RNA，有必要使用适当的核酸酶。
不需要前期处理，吖啶橙就可以鉴别DNA 与 RNA 。吖啶橙与 DNA 结合后，最大激发/发射波长为 502 nm/525 nm，而与 RNA 结合后，最大激发/发射波长为460 nm/650 nm。此外，它还能够进入溶酶体等酸性区室。在这里，阳离子染料被质子化。在这种酸性环境下，吖啶橙由蓝色光谱中的光激发，但发射波长在橙色区域到达最大。由于凋亡细胞具有大量被吞噬的酸性区室，因此，吖啶橙常用作此类细胞的标记物。
6区室和细胞器特异性染料
在荧光显微镜技术中，往往要对溶酶体、核内体等细胞区室以及线粒体等细胞器进展染色。为此，该局部介绍了一系列可供选