实验报告亲和层析法纯化胰蛋白酶.doc

文档介绍：-
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亲和层析法纯化胰蛋白酶
一．实验目的
，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；
〕,再用100ml蒸馏水淋洗。接着用50ml亲和洗脱液〔
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—=〕淋洗。最后用蒸馏水洗至中性，浸泡于亲和柱平衡〔-=-HCl缓冲液〕中，放冰箱待用。

取层折柱一支，柱装入1/4体积的亲和柱平衡液，亲和吸附剂一次装入柱，自然沉降，调好流速(2-4ml/min)，亲和柱平衡液洗至流出液在检测仪上绘出稳定基线，。，过滤，取清液上柱吸附，亲和柱平衡液流至流出液在检测仪上绘出的曲线回归到原来基线水平，。用亲和柱洗脱液洗脱，收集胰蛋白酶峰，测胰酶的比活及含量。
整个实验流程为：
鸡蛋清 Spharose4B
↓↓
提取 活化
↓↓
别离纯化 ↓
↓↓
纯卵粘蛋白(CHOM)→←活化Spharose4B
↓
偶联
↓
CHOM-Spharose4B→←胰蛋白酶提取液
↓
亲和层析
↓
酶促动力学←纯胰蛋白酶→酶含量、活性测定
实验结果
鸡卵黏蛋白浓度值
将稀释6倍测得A280nm=：
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鸡卵黏蛋白浓度〔mg/ml〕=≈，，则需要再稀释10倍，测定A280nm=，
鸡卵黏蛋白抑制比活性值
工程
A253
T/s ttttttttttttttt/s
0
30
60
90
120
150
180
210
240
未加抑制剂的胰蛋白酶









参加抑制剂的胰蛋白酶
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未加抑制剂
参加抑制剂
(1)胰蛋白酶活性〔BAEE〕=，则未加抑制剂的胰蛋白酶的∆A253nm/min=(-)/(4*)=
(2)胰酶比活性〔BAEE/mg〕===9722BAEE/mg
(3)鸡卵黏蛋白比活性〔胰蛋白酶BAEE/mg〕=
==7520BAEE/mg

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淋洗液
滤液体积/ml
OD280
NaCl溶液