文档介绍：关于基因工程基本操作程序
第1页，讲稿共52张，创作于星期日
一、目的基因的获取
1. 基因的结构

第2页，讲稿共52张，创作于星期日

（1）原核
（2）应用PCR技术扩增目的基因
①定义：
②原理：DNA双链复制
PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项在生物体外复制特定DN***段的核酸合成技术，在短时间内大量扩增目的基因
DNA分子热变性（在90～95 OC时，解旋，双链分开温度降低又结合成双链）因此，在PCR技术中不需要解旋酶（与复制不同之处)
③仪器：
PCR扩增仪（自动调控温度的仪器）
④条件：
有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，三磷酸脱氧核苷酸dNTP，酶等。
第14页，讲稿共52张，创作于星期日
④过程：
（90～95 OC)：
（55～60 OC)：
（70～75 OC)：
：
双链DNA模板在热的作用下，氢键断裂形成单键DNA
系统温度降低，引物结合到互补DNA链上，形成局部的双链DNA
在Taq酶作用下，合成与模板互补的DNA子链，形成双链DNA
每重复一次，目的基因增加一倍
PCR扩增为指数形式扩增2n(n为扩增循环的次数），在短时间内扩增大量目的基因。
第15页，讲稿共52张，创作于星期日
怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因
根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
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以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤
一、待测核酸样品的制备
（一）制备待测DNA
将基因文库中的所有菌落裂解，用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA （如量不够可用PCR扩增）
（二）DNA限制酶消化
基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。消化后电泳分离DNA
（三）DNA变性：分离后移至于碱性溶液中浸泡，DN***段经过碱变性作用，形成单链状态。单链DN***段转移到固相（一种特制的膜）支持物上。
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以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤
二、探针标记：通过PCR方法将目的基因已知的部分核酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记，即用标记了放射性同位素的目的DN***段作为探针，将标记的DNA探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性成单链。
三、Southern杂交：将待测单链DNA滤膜和标记的探针单链DNA放入杂交液中即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。
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以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤
四、放射性自显影检测
将杂交后的滤膜，放入有2张X光底片暗盒中，使滤膜对X光底片曝光然后冲洗X光底片，在膜上阳性反应（杂交带）。
主要应用

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(3)用化学方法直接人工合成目的基因
蛋白质氨基酸序列→mRNA的核苷酸序列→目
的基因序列→目的基因
针对：基因比较小，核苷酸序列又已知
推测
化学合成
思考：
不具有，缺少非编码区(启动子、终止子）和非编码序列（如内含子），要人工构建。
人工合成的目的基因是否具有完整基因结构的基因？
推测
第20页，讲稿共52张，创作于星期日
：
二. 基因表达载体的构建——核心
IMN
：
①使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代。
②同时使目的基因能表达和发挥作用。
(3)终止子：是使转录在需要的地方停止
(4)标记基因：是鉴别受体细胞中是否含有目的基因从而将含有目的基因的细胞筛选出来
(2)启动子：是RNA聚合酶识别和结合部位
(1)目的基因
不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。
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质粒
DNA分子
限制酶处理
一个切口
两个黏性末端
两个切口
获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
基因表达载体的构建
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寻根问底：