目的基因的分离和制备.docx

文档介绍：目的基因是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。 获得目的基因的方法很多，但也是十分困难的一步。目前获得目的基因有4 条途径：
原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性目的基因是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。 获得目的基因的方法很多，但也是十分困难的一步。目前获得目的基因有4 条途径：
原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标 记的核酸探针，从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。 图 10-3-1 限制性内切酶
限制性内切酶(restrictive enzyme)是20世纪60年代末在细菌中发现的，能水解DNA分子骨 架的磷酸二酯键，使一个完整的DNA分子切成若干段，每一种限制酶，都有自己特定的作 用位点，而且切口或切下来的序列，往往是回文结构(palindromes)。例如Eco RI把GAATTC 在 GA 之间切开，形成粘性末端。也有一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端， 如HapI。多在原核生物中存在，能识别4〜6个特苷酸特定的碱基序列。限制酶对细菌有保 护作用，某些入侵的噬菌体可因DNA链被限制性酶切断而不能在细菌中繁殖，“限制”因 此而得名。限制酶不能切开细菌本身的DNA，这是因为细菌DNA的腺嘌吟和胞嘧啶*** 化(-CH3)而受到保护之故。
这样就可以用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段，对于原核生物比较小的基因 组来说，可以直接用标记地探针来获取在通过特定的方法，对于比较大的基因组，可以先制 作基因文库，然后钓取所需要的带有目的基因的片段。
2•人工合成目的基因DN***段
人工合成目的基因DN***段有化学合成和酶促合成法两条途径。一般是采用DNA合成 仪来合成长度不是很大的DN***段。
PCR反应合成DNA
聚合酶链式反应(PCR)是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术 获取所需要的特异DN***段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一 定的了解，需要设计引物。PCR技术的原理如下：
图10-3-2 PCR原理图
以混合的DN***段作模板，例如，可以用cDNA基因文库做模板，在90°C高温 下，作为模板的双链DNA均变性，分开成为单链DNA。
在反应体系中以有两种合成的 DNA 小段寡聚核苷酸做引物，这两种寡核苷酸应可以 分别和特异 DNA 片段的正链的 3'末端与负链的 3'末端相结合。寡核苷酸引物要在 50C 的温度下，才能较好的找到可以配对的正链和负链，形成互补结合。显然，在混合 DNA 片 段作模板的情况下，只有可以形成配对关系的 DNA 链才可特异性地结合引物寡核苷酸。 这个过程又称为淬火。
反应体系中还有高温 DNA 聚合酶，以及作为原材料的四种脱氧核苷三磷酸( 4 X dNTP) 。高温 DNA 聚合酶来自一种特殊的耐高温细菌，俗称 Taq 酶。