文档介绍：常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒 DNA 的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用
的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
目前常用的感受态细胞制备方法有括：模板 DNA、寡核苷酸引物、Mg2+，4 种脱氧核糖核
酸（dNTP）、DNA 聚合酶和合适的缓冲体系。反应基本程序包括 DNA 变性、引物复性及引
物延伸三个基本过程。这三个反应构成一个循环，反复进行。每一轮循环扩增的产物可作为
下一轮扩增反应的模板。理论上每一轮循环可使 DNA 数量增加一倍，反复 30 次，特异 DNA
序列片段以指数方式可扩增 105~106。通过此技术可以使非常微量的 DNA 产生大量的 PCR
产物，因此这个技术是一项在体外大量生产目的基因的技术。
现在普遍通用的是一种从水生嗜热杆菌中提取的 Taq DNA 聚合酶，而且大大提高了扩增片
段的特异性、灵敏性和扩增效率。反应中用的引物有两段，一条称为上游引物或者正向引物，一条称为下游引物或者反向引物。引物的设计十分重要，在设计时应遵循以下原则：长度一
般为 18 到 24 个碱基；G+C 的百分含量在 40%~60%；单条引物内部避免含有二级结构，避
免形成引物二聚体；最好以 1 到 2 个 G 或 C 碱基开始或结束；引物的 5’端可以被修饰，但
是 3’端绝对不能进行任何修饰，而且引物的 3’端要避开密码子的第三位。模板的浓度不
能太大，dNTP 的浓度为，金属离子的浓度为，缓冲液为 pH 为 ~
的 Tris—HCl 溶液。

实验材料：
菌株： DH 5α
培养基： LB 培养基、麦康凯培养基（加入氨苄青霉素）
试剂材料：
酶切反应：（DNA PUC19 质粒，酶切 10×buffer，Hind Ⅲ,重蒸，水 λ DNA。）
连接反应：（酶切后的 DNA PUC19 质粒和λ DNA，连接 10×buffer，T4 连接酶，重蒸。水）
感受态细胞的制备：（ CaCl2 ）
转化：（连接液和感受态细胞， CaCl2，冰块。）
重组菌的挑选、检验：试剂盒（含有 Rnase A 的溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，HB buffer,DNA
washing buffer，elution buffer）,酶切后的 DNA PUC19 质粒，试剂盒抽提的 DNA，酶切
10×buffer，Hind Ⅲ,重蒸，水琼脂糖， TAE 缓冲液。上样缓冲液，EB 染液。
PCR 检测：