文档介绍：关于紫外分光光度法的应用
第1页，讲稿共39张，创作于星期二
一、物质对光的选择性吸收
●物质的颜色由物质与光的相互作用方式决定。
●人眼能感觉到的光称可见光，波长范围是：400~760nm。
●让白光通过棱镜，能色散出红、橙ax>104，弱带： max<103
特征值
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吸收光谱 特征值： λmax λmin λsh
●同一物质的吸收光谱特征值相同, (每一波长处吸光系数相同)。
同一物质相同浓度的吸收曲线重合。
●同一物质不同浓度，其吸收曲线形状相似,λmax相同。（定量）
●不同物质相同浓度，其吸收曲线形状,λmax不同。（定性）
定性、定量分析：
在吸收曲线λmax 处测吸光度A。
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吸收曲线的讨论：
（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax
（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。
（3）③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。
（4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在λmax处吸光度A 的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。
（5）在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。
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五、偏离光的吸收定律原因
朗伯-比尔定律：A=k C L
依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线
（一）化学因素
（二）光学因素
偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面：
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该定律适用于稀溶液，溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会引起偏离。
尤其浓度过高(>)会使C与A关系偏离定律：
①粒子相互作用加强，吸光能力改变。
②溶液对光的折射率显著改变。
故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。
溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。
例： 铬酸盐或***盐溶液中存在下列平衡：
CrO42- ＋2H＋ = Cr2O72- ＋H2O
溶液中CrO42-、 Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH 对测定有重要影响。
（一）化学因素
朗—比耳定律假定所有的吸光质点之间不发生相互作用；
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（二）光学因素
1．非单色光的影响：入射光为单色光是应用该定律的重要前提：
2．杂散光的影响：仪器本身缺陷；光学元件污染造成。
3．反射和散色光的影响：散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形。 通常可用空白对比校正消除。
4．非平行光的影响：使光程↑，A↑，吸收光谱变形。
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紫外-可见分光光度计
依据朗伯-比尔定律，测定待测液吸光度A的仪器。（选择不同波长单色光λ、浓度）
光源
单色器
吸收池
检测器
信号处理及显示
分光光度计外观
分光光度原理图:
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一、主要部件
：
：包括狭缝、准直镜、色散元件
钨灯或卤钨灯
氢灯或氘灯
—可见光源 350~1000nm
—紫外光源 200~360nm
色散元件
棱镜
光栅
对不同波长的光折射率不同
衍射和干涉,不同波长的投射方向不同
玻璃棱镜:适用于可见区
石英棱镜:适用于紫外区
高度抛光的玻璃上刻有等宽、等距平行条痕
狭缝：进出光狭缝。
准直镜：复合光→平行光→色散后→聚集狭缝
最佳宽度:减小狭缝宽度而溶液吸光度不变。
：比色皿、比色杯，装样品溶液。有玻璃、石英杯两种
：光→电，光电池(硒,硅)，光电管(红,紫)，光电倍增管。
：放大较弱的电信号，并在检流计上显示出来。
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比色皿：玻璃VS石英杯
适用的波长范围不一样
石英的范围更广,波长最小可以到达210nm,可以用在紫外光程,一般测核酸和蛋白都用石英比色皿,基本上测什么试剂都可以,但价格高,一般一个都要在几百块人民币
玻璃的局限性大一些,主要用于可见光程,相对便宜 现在市场上塑料比色皿也在流