文档介绍：实验三 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定蛋白质相对分子质量

一、实验目的
二、实验原理
三、实验步骤
本节课的内容
一、实验目的
学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理。
掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。
二、实验原理
电泳的基本知识和原理
SDS的性质与作用
聚丙烯酰胺凝胶的性质
什么是电泳?
电泳(electrophoresis)是指带电颗粒在电场中的泳动。许多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都含有可电离基团,在非等电点条件下带有电荷,在电场力的作用下,它们向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异,在电场中的迁移速度不同,从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。
电泳的基本知识和原理
影响带电粒子在电场中泳动的因素
:待分离生物大分子所带电荷的多少、分子大小和性质都会对电泳产生明显影响。
:缓冲液pH值直接影响生物大分子的解离程度和带电性质.
溶液pH值距离等电点愈远,生物大分子所带净电荷就越多,电泳时速度就越快。当缓冲液pH大于等电点时,生物大分子带负电荷,电泳时向正极移动;当缓冲液pH小于等电点时,生物大分子带正电荷,电泳时向负极移动。
电泳的基本知识和原理
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电场强度指每单位介质长度的电位梯度(又称电位差或电位降)。
一般而言,电场强度越大,电泳速度越快。
但随着电场强度的增大会引起通过介质的电流强度增大,从而造成电泳过程产生的热量增多,最终导致介质温度升高。降低电流强度,可以减少产热,但会延长电泳时间,引起生物大分子扩散增加,同样影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度。
电泳的基本知识和原理
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液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。
由于支持介质表面存在一些带电基团,如滤纸表面含有羧基,琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支持介质表面带电,吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动,形成介质表面溶液的流动。
当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度;当电渗方向与电泳方向相反时,则降低电泳速度。
电泳的基本知识和原理
:支持介质的筛孔大小对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快,反之则泳动速度慢。
电泳的基本知识和原理
电泳技术的分类
1. 根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳:①自由电泳不使用支持介质,电泳在溶液中进行。②区带电泳需使用支持介质,根据支持介质不同可分为醋酸纤维薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。根据支持介质的装置形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘状电泳、毛细管电脉等。
:①高压电泳使用的电压在500~1000V,这类电泳分离速度快,但热效应较大,必须具备冷却装置,主要适用于小分子化合物的快速分离。②常压电泳使用的电压在500 V以下,电位梯度为2~10 V /cm。这类电泳的分离速度较慢,但对电泳设备要求简单。
电泳的基本知识和原理