文档介绍：SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量*【目的要求】学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。*【实验原理】电泳带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。在一定的电场强度下,分子在凝胶介质中的迁移速率取决于分子的大小、构型和带电量的大小。PAGE聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP)的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。*CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CHC=ONHCH2NHC=OCH2-CHCH2¯CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m*PAG机械强度好,有弹性,透明,化学性质稳定,改变Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。*SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液,SDS是一种很强的阴离子表面活性剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。【SDS-PAGE基本原理】强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。*蛋白质分子结合SDS阴离子后,所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷,从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。*将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE中的电泳迁移率对分子量的对数作图,即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率,就能根据标准曲线求得其分子量。当蛋白质的分子量在17,000~165,000之间时,蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系:lgMW=K-bm**【操作方法】1、制胶玻板的清洗用海绵和洗涤剂轻柔地清洗,严禁使用刷子和颗粒状的去污粉与洗衣粉,完全冲洗干净后烘干。*