文档介绍：荧光偏振与荧光偏振免疫分析法
【摘要】本文简单介绍了荧光偏振原理和荧光偏振免疫分析(FPIA)的原理,并就荧光偏振及FPIA在环境、食品安全、医疗卫生和蛋白质研究等方面的实际应用进行了简单介绍和举例。
【关键词】荧光偏振免疫分析应用
荧光偏振与荧光偏振免疫分析法
【摘要】本文简单介绍了荧光偏振原理和荧光偏振免疫分析(FPIA)的原理,并就荧光偏振及FPIA在环境、食品安全、医疗卫生和蛋白质研究等方面的实际应用进行了简单介绍和举例。
【关键词】荧光偏振免疫分析应用
从1852年,Stokes首次提出“荧光(fluorescence)”一词,
人们对荧光现象的研究就不断深入,并发展出了荧光分析技术,荧光分析是指利用一些物质被电磁辐射激发后产生反映该物质特性的荧光而对该物质进行定性定量分析的方法。随着相关理论和仪器的发展,荧光分析的手段和技术水平也不断发展,现在荧光分析以其高灵敏度、高选择性、低样品用量、方法简便等诸多优点,在化学、医药、环境、信息、生命科学等领域被人们广泛使用。基于荧光偏振发展的荧光偏振免疫分析法是荧光分析中一个重要的组成部分。
一、荧光偏振原理
荧光偏振的原理最初是1920年由Perrin建立的。溶液中荧光分
子受偏振光激发,如激发时分子保持静止,则发射的荧光仍有偏振性,且如分子分子旋转或翻转,发射荧光的偏振平面会不同于激发光偏振平面。虽然实际测量常得消偏振的荧光,但荧光偏振技术有着重要应用[1]。
荧光偏振光强度P定义为:
P=(I-I)/(I+I)
丄〃丄〃
其中,I和I表示荧光子被激发后,发射光在垂直和水平方向上的强丄〃
度。对于荧光偏振仪器,检测到的荧光强度:
P=(I-GXI)/(I+GXI)
vvvhvvvh
式中,下标分别代表起偏器和检偏器方向,v为垂直方向,h为水平方向,G为校正因子,G=I/I。荧光偏振光强度P与测定体系中各hvhh
因素的关系可用Perrin方程表示:
(l/P-1/3)=1/P+(l/P+1/3)(RT/V)(T/n)
00
其中,P为极限荧光偏振光强度,R为气体常数,T为绝对温度,V0
为摩尔分子体积,t为荧光寿命,n为溶液的粘度。由上式知当溶液的温度和粘度都固定时,P值主要取决于荧光子的分子体积。荧光偏振光强度与荧光物质受激发时分子转动速度成反比,所以小分子物质在溶液中旋转速度快,P值较小;大分子物质在溶液中旋转速度较慢,P值较大⑵。
二、荧光偏振免疫技术原理
荧光偏振免疫方法(fluorescencepolarizationimmunoassay,
FPIA)依据荧光标记抗原和其抗原抗体结合物之间荧光偏振程度的差
异,用竞争性方法直接测量溶液中小分子的含量[2]。
在反应体系内加入未标记抗原(待测抗原)和一定量用荧光素标记的小分子抗原,使二者与特异性大分子抗体竞争结合。当待测抗原浓度高时,大部分抗体被其结合,荧光素标记的抗原多呈游离的小分子状态,小分子在液相中转动速度较快,测量到的荧光偏振程度也较低。反之,大部分荧光素标记抗原与抗体结合,形成大分子的抗原抗体复合物,检测到的荧光偏振程度也较高。荧光偏振程度与待测抗原浓度呈反比关系,利用这一原理,可以精确地得知样品中待测抗原的相应含量。FPIA还可以对抗体进行检测。
三、荧光偏振