文档介绍：项目名称:
非人灵长类克隆及治疗性克隆的机理研究
首席科学家:
周琪中国科学院动物研究所
起止年限:

依托部门:
中国科学院
一、研究内容
深入了解在灵长类体细胞克隆胚分化与去分化过程中基因与蛋白表达、转录调控及信号传导的分子机理是本项目拟解决的关键科学问题。
本项目的研究重点包括:
1. 完善动物克隆技术,尝试建立具有自主知识产权的无性繁殖技术
以改进核移植流程,提高克隆效率为主,探讨建立非细胞体系的无性繁殖技术的可能性。

探索和发现卵母细胞中与体细胞去分化相关的关键蛋白、化学物质。对于启动重编程相关的关键蛋白和化学物质进行深入研究,设计调控基因表达的主要成分表,控制发育进程。

研究Nanog、Oct4等转录因子的各个结构域在行使功能时发挥的作用; 以胚胎干细胞未分化的标志性转录因子Oct4及Nanog为核心,研究由其调控的下游基因及其相互关系。

研究细胞核在细胞质环境中的三维结构变化,找到细胞核重编程的结构基础,研究分化是如何发生的及基因的动态表达过程,找出决定分化的基因网络。
具体回答的问题包括:
建立有效、经济的灵长类动物核移植方法,解决核移植效率低下的问题。
灵长类克隆胚在重编程过程中卵母细胞质因子的作用,找到参与体细胞核移植后重编程过程的关键蛋白质并阐明其在这一过程中所起的作用。
表观遗传修饰印记的消除对灵长类动物克隆胚发育的影响。
在胚胎干细胞维持其多能性的过程中,重要转录因子的调控机制。
胚胎干细胞向神经干细胞发育过程中的信号通路和基因调控。
揭示灵长类基因组的差次表达模式和中枢神经系统发育的分子基础。
主要研究内容:
对灵长类动物卵及早期胚胎生化特性及基因组表观遗传修饰进行研究;灵长类动物种间核移植研究;筛选、制备灵长类动物核供体细胞;建立有效、经济的灵长类动物核移植方法。
克隆灵长类动物;从克隆胚胎中分离胚胎干细胞并建系。
在胚胎基因组激活过程中,比较正常胚胎和核移植胚胎基因表达谱的差异;分析差异表达基因在核内的定位;分离在胚胎早期发育过程中起重要作用的新的转录因子;研究受精卵和克隆胚在着床前胚胎发育过程中基因的表达和调控。
研究表观遗传修饰印记的消除对灵长类动物克隆胚发育的影响。
研究Nanog、Oct4等转录因子的各个结构域在行使功能时发挥的作用; 以胚胎干细胞未分化的标志性转录因子Oct4及Nanog为核心,研究由其调控的下游100个基因及其相互关系
;Oct4、Nanog调控基因表达的实验研究; Oct4,Nanog在胚胎干细胞中的表达调控研究。
采用蛋白质组学技术研究成熟卵母细胞、激活卵母细胞、受精卵的蛋白质表达谱,用生物信息学方法构建相关蛋白质组学数据库,并通过比较这些蛋白,或者蛋白磷酸化等差异,获得其中参与细胞由分化转为未分化的程中起关键作用的蛋白质,并对其蛋白表达,翻译后修饰和功能进行进一步研究。
研究在HGF和bFGF条件下,胚胎干细胞向神经干细胞分化的基因表达差异和HGF和bFGF引起的相应受体磷酸化。重点为HGF和bFGF与其受体结合后引起哪些位点的酪氨酸残基发生了磷酸化,以及不同浓度的HGF和bFGF引起磷酸化的强弱。
研究导致神经干细胞分化的信号通路。包括:
HGF和bFGF引起的相应受体磷酸化的信号通路,重点研究Ras,ERK,MAPK,PI3 kinase,PLC-γ,STAT3,Src,RhoA-ROCK等通路对神经干细胞分化的影响;
脂筏(lipid rafts)在HGF和bFGF存在的条件下,对神经干细胞分化的影响。
Notch和Wnt信号通路,对神经干细胞的分化的作用。
采用DNA芯片技术对恒河猴(Macaca mulatta)正常胚和体细胞克隆胚不同发育时期(从囊胚期、原肠胚、神经胚到大脑形成)的基因表达模式进行分析,寻找在神经系统发育过程中特征性表达的基因和基因家族;同时,比较人和恒河猴胚胎干细胞诱导分化为神经样细胞前后基因表达图谱的差异,揭示参与神经系统分化的基因和基因家族。
二、预期目标
总体目标:
利用核移植手段获得体细胞克隆恒河猴,揭示动物克隆和治疗性克隆研究中的细胞去分化和分化的分子机制。
五年预期目标:
建立高效的灵长类核移植方法,克隆恒河猴;从克隆胚胎中分离ES细胞系;
揭示Nanog、Oct4等多能性转录因子的结构基础及在蛋白水平上的调控机制;并确定和克隆它们的下游因子,探讨其作用机制;
获得诱导体细胞重编程的关键蛋白并阐明其作用机制;
发现恒河猴体细胞核移植后早期胚胎发育过程中表达的重要基因及其功能和作用方式;研究遗传印记对克隆胚发育的影响;
了解恒河猴胚胎