SiRNA的发展历史,原理,应用的最新进展和发展趋势 PPT课件.ppt

文档介绍：Then how to get siRNA?
siRNA制备方法
In vitro
A、化学合成
B、体外转录
C、酶切长链dsRNA
In vivo
D、载体表达siRNA
E、PCR合成siRNA表达元件
A. 化学合成法
方法简单、快速,需要时间短;获得的siRNA纯度高
适用于短期体外实验研究,尤其适用于需要单一siRNA序列的研究
siRNA可进行标记
需要进行大规模的筛选来确定单一的siRNA序列
不适用于长期研究
不适用于siRNA序列的筛选
选择以AA开头的19-21nt长的序列
靶定序列从起始密码子下游75-100个nt处开始,到终止密码子上游75-100nt处结束
选择 2-4个靶定序列,以筛选特异性最好的进行实验
选择的序列中 GC含量在 30-70%,最好在50%左右,在一排序列中避免出现3 个以上G。
若需要发卡结构,发卡部分长度一般为6-9nt,有文献报道9nt效果较好.
最后,选择的DNA 片段经BLAST 查询,应与其它人类基因无同源性
设定适当的对照
siRNA序列设计注意事项
设置适当的siRNA对照
1) 与靶定siRNA有相同的碱基组成,但排列完全不同,且不与其它基因由同源性
TAG SN(G4,C5,A5,T6)
ATTCGTGCTCAATGCAATCG NSN(G4,C5,A5,T6)
2)1-2碱基错配的 siRNA对照(1-2nt)
TAG
TAG T 和 A错配
siRNA序列设计
根据文献报道,使用确定的siRNA序列
许多网站提供siRNA设计软件,只需输入靶定基因序列,即可提供候选siRNA序列;比如Ambion公司,武汉晶赛
B、体外转录合成短的siRNA
T7 RNA 聚和酶体外转录DNA,直接产生小片断的siRNA,
快速、灵活,适用于siRNA序列的筛选以及化学合成siRNA价格昂贵时
siRNA可进行标记
可重复性差,不适用于长期研究和需要大量单一siRNA序列的研究
C、使用Dicer酶切长片断dsRNA产生siRNA
使用T7RNA聚和酶体外转录,产生长片断的dsRNA,然后使用Dicer酶消化,产生短的siRNA
产生的为siRNA的混合物,因此沉默效果较好
该方法方便、简单、需要时间短,容易操作适用于快速而便宜的表型功能缺失研究
可对产生的siRNA进行标记
不适用于长期研究和需要确定的单一siRNA的研究
可能产生非特异性的基因沉默
1、含有T7启动子的PCR产物的合成
2、长的dsRNA的转录合成
3、 siRNA的消化,和纯化