文档介绍：谨以此论文献给所有关心、支持和帮助过我的亲徐晓丽人、师长和朋友们
德~骷饧吁:敞跆锈纷%,弓舨砖对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒检测抗体芯片的制备与应用%够雨砑小.,学位论文完成日期:指导教师签字:答辩委员会成员签字:生三且‘
学位敝储躲涂锄导师粹扃学位论文作者签名:余弧┳秩掌冢杭觙晁暝露呷签字日期::奎拦亘窒蚱渌逃沟难换蛑な槭签字日期:阩月;。日本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,并同意以下事项:⒀S腥ūA舨⑾蚬矣泄夭棵呕蚧顾徒宦畚牡母从〖痛排蹋市论文被查阅和借阅。⒀?梢越宦畚牡娜ú炕虿糠帜谌荼嗳胗泄厥菘饨屑焖鳎梢采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学”中国学术期刊馀贪电子杂志社”用于出版和编入《中国知识资源总库》,授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。C艿难宦畚脑诮饷芎笫视帽臼谌ㄊ
对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒检测抗体芯片的制备与应用摘要病毒性疾病严重威胁着水产养殖业的健康快速发展。鉴于目前病毒病尚无有效的治疗方法,病毒的早期准确检测对疾病的预防和控制尤为重要,因此建立一种多样品、多指标检验并行处理的简便、快速、灵敏、准确的病毒检测方法对病毒病的防控具有重要意义。新兴的抗体芯片技术结合了抗原抗体反应的特异性和芯片高密度集成优势,只需少量生物样品,一次检测便可获得几种甚至几万种有关的生物信息或疾病的检测结果,在人类疾病中病原/疾病标志物等的检测上己显示出广阔的应用前景。但尚未发现有利用抗体芯片法检测水产动物病毒的相关报道。本文将单克隆抗体タ技术、免疫标记技术和抗体芯片技术相结合,以目前水产养殖中的重要病毒病的病原对虾白斑症病毒琖和鱼类淋巴囊肿病毒琇为模式病毒,建立了水产动物病毒检测抗体芯片制备体系,优选了芯片载体,优化了反应条件,研究了点样缓冲液、抗体浓度、固定时间、封闭剂种类和浓度、、不同标记显色方法等对芯片灵敏度的影响,制备了对虾检测抗体芯片和鱼类检测抗体芯片,并将其用于/的检测。具体研究结果如下:攵孕酒靥宓难≡窈痛硎侵票父咧柿靠固逍酒墓丶疚闹票噶琼脂糖凝胶、丙烯酰胺凝胶、、醛基、巯基、多聚赖氨酸修饰玻片,综合分析了以上植煌奘蔚牟F鞍被F⑾跛嵯宋ぁ共植煌靥宥钥固宓墓潭ㄐ屎托Ч=、均匀,无边缘扩散和拖尾现象,信号值最高,而其他载体都有不同程度的拖尾现象,表明琼脂糖凝胶修饰玻片对抗体的固定能力和固定效果最好。原子力显微镜显示琼脂糖凝胶修饰玻片表面为均匀的三维多孔结构,平均表面粗糙度为.,结合琼脂糖凝胶表面经罨蟮娜┗牛芄灰晕理吸附和共价结合的方式牢固的固定抗体。因此后续实验采取琼脂糖凝胶修饰玻片作为抗体芯片的载体。对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒检测抗体芯片的制备与应用
咖蚈.’检测抗体芯片的灵敏/.乜范围内,荧光信号强度与度均为癵/。浓度在訵疞《玖W游DJ讲《荆捎盟ǹ固寮行姆绞浇⒘怂动物病毒的抗体芯片检测体系。提纯/病毒粒子,制备病毒的兔抗血清,纯化后进行特性分析。结果显示纯化后得到了高活性、高效价的兔抗及兔抗抗体,效价分别为和。复苏本研究室前期制备的/单抗杂交瘤细胞株,采用腹水生产方法获得大量/单抗,辛酸硫酸铵法结合缀筒阄龃炕进行特性分析。结果显示纯化后/单抗效价均为,具很好的活性。采用固灞昙鞘约梁源炕蟮母咝Ъ鄣タ棺鰿标记,制备了特异性检测/的抗体探针,昙呛骔疞タ固秸的工作浓度分别为:。灾票傅耐每筗疞嗫寺】固逦2痘窨固澹眯⌒褪侄酒样系统将其点样于优选的琼脂糖凝胶修饰的芯片载体上,制备/检测抗体芯片。选用特异性强的昙堑腤疞タ刮<觳饪固濉?固芯片与/病毒稀释液孵育形成复合物,该复合物被昙堑奶匾性/单抗探针识别,经酒枰嵌寥〗峁Mü谋湫酒备及应用过程中的具体条件参数,对点样缓冲液、点样抗体浓度、固定时间、封闭剂种类和浓度、洗涤方法、、不同标记显色方法进行了优化,得到芯片制备与应用的最佳条件。结果显示,点样用捕获抗体采用含%甘油的髡胶鲜逝ǘ兔抗抗体为/,兔抗抗体为/械阊阊笮酒姹ズ褪6裙潭%牛血清白蛋白于℃饱和湿度封闭来斡胐吹樱看干后低温密封保存。芯片与捕获抗体的反应时间为~觳饪固逵胄酒上的抗原抗体复合物的反应时间灰3芯苛瞬煌靥濉⒉煌昙俏包括辣根过氧化物酶珻,异硫氰酸荧光素,胶体金和生物素昙堑タ褂米骷觳饪固濉⑿酒4媸奔等对检测灵敏度的影响。结果显示