文档介绍：东北农业大学
硕士学位论文
产紫杉醇的红豆杉内生真菌研究
姓名:李嘉琳
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:陈维多
20060620
摘要使内生真菌深入红豆杉的木质部深处,从而使合成紫杉醇较高的部位不局限于树皮。本论文以红豆杉及其内生真菌为主要试验材料,对产紫杉醇的内生真菌进行了定性和定量分析,同时根据紫杉醇合成途径中的关键酶首次讨论了其遗传学基础,并建立了一种快速经济的筛选产紫杉醇内生真菌的方法。透明颤菌血红蛋白虺功电转化其中一株内生真菌。构建出在厌氧或限氧条件下生长速度显著加快的转基因的工程菌,这对于发酵法工业生产紫杉醇来说具有良好的应用价值。於股寄谏婢姆掷胗氪炕将采集的红豆杉枝条表面消毒后,置于含培养基的三角瓶中,待内生真菌长出后,挑取尖端菌丝置于含嘌钠桨逯校ぢ桨搴螅艏舛司恐糜诹硪缓珻培养基的平扳中,如此重复橐陨希吹玫酱炕哪谏婢辍仙即寄谏婢募将筛选到的内生真菌用传统的琀椒ń屑ǎ玫饺瓴仙即嫉哪谏婢并进行了定量分析,紫杉醇产量分别达到疞。根据真核生物蛄斜守区发计了一对引物,对三株内生真菌的形态及扩增得到的涡蛄薪胁舛ê治觯醪浇羌ㄎ狥属蚉属於股寄谏婢仙即枷喙鼗駼苯丙氨酸侧链辅酶;R泼的鉴定及初步研究根据基因保守区设计引物,在内生真菌及其宿主中┰龅玫较嘤ζ希蛄胁定及治觯砻骼醋阅谏婢腂蚱涡蛄杏牒於股糂蚱尉哂蟹浅高的相似性,因此我们推测,红豆杉内生真菌之所以能够合成紫杉醇,是由于从其宿主中摄取了紫杉醇合成途径中的酶的基因,即其遗传学起源是基因转移而不是共进化。同时也建立了一种快速经济的鉴定产紫杉醇真菌的辅助方法。孔;哉婢幕蚋牧将由实验室构建的质粒以除草剂为抗性基因,1ǜ婊颍玍基因置于香菇舳拥骺叵用电转化的方法转化真菌,得到的阳性菌株在氧气不足或缺氧条件下明显提高了生长速度,这对于发酵法工业生产紫杉醇来说具有良好的应用价值。此外,转化虻墓こ叹暝诤於股加胝婢墓采逑抵幸簿哂醒芯考壑担鏥基因是否能关键词:红豆杉:内生真菌:紫杉醇;:夯蜃R狢畉
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导师签名:面、穆吼伽衫年/月/钿学位论文作者签名:学荔珠学位论文作者签名:李誊诅隶日期:劢。存码廊日期:钞口缉加/‘日独创声学位论文版权使用授权书明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,学校有权保本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。C艿难宦畚脑诮饷后适用本授权书研究生学位论文独创性说明和使用授权书
目的与意义口紫杉醇释ㄓ妹鸓巧细鍪兰土甏拦蒲Ъ掖犹窖蠛於股贾分离提取的一种二萜类化合物,魑R恢天然的次生代谢产物,经临床验证,具有良好的抗肿瘤作用,特别是对癌症发病率较高的卵巢癌,子宫癌,乳腺癌等有特效是近年来在抗癌领域的重大发现,已于年被美国食品和药物管理局嘉V瘟谱移性卵巢癌的新药并已上市。近年来地球人口和癌发率呈爆发性增长,.对紫杉醇的需求量亦明显增大,目前紫杉醇的供应还主要赖于传统的从红豆杉中提取,有人估算过,.氖髌げ拍芴岢鰈淖仙即迹疗一个卵巢癌患者需要冒倌暌陨系暮於股迹惨虼嗽斐闪硕院於股嫉拇罅靠撤ィ率这种珍贵树种已濒临灭绝。人们也一直在尝试利渌姆椒ㄉ仙即迹踩〉昧瞬簧俚某杉āV钊缁Ш铣煞ǎ半化学合成法,细胞组织培养等:ê铣稍谔逋獬⑹粤俗仙即嫉暮铣刹⒒竦贸晒Γ个过程非常昂贵而且产量不高,并非一个理想途径。,半合成虽然有效,但从植物组织中分离纯化半合成前体亦较为困难唬。橹嘌枰5牟街杞衔<虻ィ仙即疾量较低,产量还有不稳定的因素唬。年,,产率达到—。同时衔#谏婢砸:铣勺仙即迹赡苡氲挚褂筛壳秩氲恼婢用有关,同时更好的模拟寄主的化学环境,在种问竞争中获得优势,U馐且桓鋈碌姆⑾郑抟筛挥锌4葱浴4撕螅鞴蒲Ъ颐窍继分离得到了多种能够合成紫杉醇的内生真菌,它们的产率高低不等。年加拿大公司的研究人员分离得到一株真菌,其紫杉醇的产率达到,这已经大大超过规模生产的盈亏平衡点陆ɑ#肮蹋钣粤⒛,使得利用真菌生产紫杉醇真正成为了一条可行的途径。利粅内生真菌生产紫杉醇有许多优点:它能够摆脱原料红豆杉稀缺的限制,而且真菌生氏速率高,能在简单培养基上进行大规模培籎琒琂,:,