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原理和方法
一、电泳方法的分类
按支持物的物理性状不同,区带电泳可为:
滤纸及其他纤维(如醋酸纤维、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维)薄膜电位;
粉末电泳,如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳;
凝胶电泳,如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶等;
丝线电泳,如尼龙丝、人造丝电泳。
按支持物的装置形式不同,区带电泳可为:
平板式电泳,支持物水平放置,是最常用的电泳方式;
垂直板式电泳,聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直板式电泳;
垂直柱式电泳,聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即属于此类;
连续液动电泳,首先应用于纸电泳,将滤纸垂直竖立,两边各放一电极,溶液自顶端向下流,与电泳方向垂直。
概念:以琼脂糖凝胶作支持体的电泳方式。
二、琼脂糖凝胶电泳
天然琼脂(agar):又名琼胶、菜燕、冻粉,从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。
琼脂糖(agarose)
琼脂胶(agaropectin)
天然琼脂(agar)是一种多聚糖,主要由琼脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖,由于这些基团带有电荷,在电场作用下能产生较强的电渗现象,加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。
琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶。
D-半乳糖
3,6-脱水-L-半乳糖
琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,其优点如下:
(1)琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需事先处理就可进行电泳。
(2)琼脂糖凝胶结构均匀,含水量大(约占98-99%),近似自由电泳,样品扩散度较自由电泳小,对样品吸附极微,因此电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好。
(3)琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。
(4)电泳后区带易染色,样品易洗脱,便于定量测定。制成干膜可长期保存。
琼脂糖凝胶电泳的缺点:
(1)机械强度差,易破碎,浓度不能太低。
(2)易被细菌污染,不易保存,临用前配制。
(3)琼脂糖支持层上的区带易于扩散,电泳后必须立即固定染色。
(4)与PAGE相比,分子筛作用小,区带少。
目前,琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸,如DNA鉴定,DNA限制性内切酶图谱制作等。由于这种方法操作方便,设备简单,需样品量少,分辨能力高,已成为基因工程研究中常用实验方法之一。
琼脂糖也可用作为电泳支持物,分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合,发展成免疫电泳技术,能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系,由于建立了超微量技术,。
琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子质量及分子构型,同时与凝胶的浓度也有密切关系。
三、DNA的琼脂糖凝胶电泳