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基因拼接的理论基础
(1)大多数生物的遗传物质是DNA。
(2)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
(3)
(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,又叫做DNA重组技术。
(一)基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)
(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性。
(3)结果:经限制酶切割产生的DN***段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较:
①相同点:都缝合磷酸二酯键。
②区别:E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌,只能将双链DN***段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶来源T4噬菌体,能缝合两种末端,但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DN***段的末端,形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体
(1)载体具备的条件:①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点,供外源DN***段插入。
③具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。
(2)最常用的载体是 质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
(3)其它载体:入噬菌体的衍生物、动植物病毒
(二)基因工程的基本操作程序
第一步:目的基因的获取
:编码蛋白质的结构基因和某些具有调控作用的因子。
(从基因文库中获取)获得,真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
(1)原理:DNA双链复制
(2)过程:第一步:加热至90~95℃DNA解链;第二步:冷却到55~60℃,引物结合到互补DNA链;第三步:加热至70~75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
(3)条件:模板,引物,热稳定DNA聚合酶(taqDNA聚合酶)
第二步:基因表达载体的构建(基因工程中的最关键步骤)
:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。
:目的基因+启动子+终止子+标记基因
(1)启动子:是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。
(2)终止子:也是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的尾端。
(3)标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来(鉴定和筛选含有目的基因的受体细胞)。常用的标记基因是抗生素基因。
第三步:将目的基因导入受体细胞_
:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
:
将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
T-DNA作用:将目的基因导入到受体细胞并整合到染色体DNA上
将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。
将目的基因导入微生物细胞:原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,最常用的原核细胞是大肠杆菌,其转化方法是:先用CaCl2处理细胞,使其成为感受态细胞(原因是:未经处理的细胞不能从外界环境中吸收DNA),再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。
,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
第四步:目的基因的检测和表达
,方法是采用DNA分子杂交技术(原理是:碱基互补配对原则)。
,方法是采用用标记的目的基因作探针与mRNA杂交(DNA-RNA分子杂交技术,原理是:碱基互补配对原则)。
,方法是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。
。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
(三)基因工程的应用
:抗虫、抗病、抗逆转基因植物,利用转基因改良植物的品质。
:提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。
:把正常的外源基因导入病人体内,使该基因表达产物发挥作用。
(四)蛋白质工程的概念
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。(基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质)
转录翻译
专题2细胞工程
(一)植物细胞工程
(原理):细胞全能性
全能性表达的难易程度:受精卵>生殖细胞>干细胞>体细胞;植物细胞>动物细胞
(1)过程:离体的植物器官、组织或细胞
(2)用途:微型繁殖(繁殖速度快,能保持亲本的遗传性状)、作物脱毒(选择植物根尖和茎尖,因为它们不含毒)、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。
(3)地位:是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。
(1)过程:
(纤维素酶和果胶酶)
(2)诱导融合的方法:物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇(PEG)作为诱导剂。(3)意义:克服了远缘杂交不亲和的障碍。(4)融合成功标志:新细胞壁的形成
(二)动物细胞工程
(1)概念:动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和繁殖。
(2)动物细胞培养的流程:取动物组织块(健康的动物胚胎或幼龄动物的器官或组织)→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
(3)细胞贴壁和接触抑制:悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁。细胞数目不断增多,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的接触抑制。
(4)动物细胞培养需要满足以下条件
①无菌、无毒的环境:培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素,以防培养过程中的污染。此外,应定期更换培养液,防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养:合成培养基成分:糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分(原因是人们对细胞所需要的营养物质还不完全清楚)。
③温度:适宜温度:℃+℃;pH:~。
④气体环境:95%空气+5%CO2。O2是细胞代谢所必需的,CO2的主要作用是维持培养液的pH。
(5)动物细胞培养技术的应用:制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。
(原理是:细胞核的全能性)
(1)哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植(比较容易)和体细胞核移植(比较难)。
(2)选用去核卵(母)细胞的原因:卵(母)细胞比较大,容易操作;卵(母)细胞细胞质多,营养丰富。
(3)体细胞核移植的大致过程是:(右图)
核移植
胚胎移植
(4)体细胞核移植技术的应用:
①加速家畜遗传改良进程,促进良畜群繁育;②保护濒危物种,增大存活数量;
③生产珍贵的医用蛋白;④作为异种移植的供体;
⑤用于组织器官的移植等。
(5)体细胞核移植技术存在的问题:
克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。
(1)动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞,称为杂交细胞。
(2)动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同,诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似,常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。
(3)动物细胞融合的意义:克服了远缘杂交的不亲和性,成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。
(4)动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较:
比较项目
细胞融合的原理
细胞融合的方法
诱导手段
用法
植物体细胞杂交
细胞膜的流动性
去除细胞壁后诱导原生质体融合
离心、电刺激、振动,聚乙二醇等试剂诱导
克服了远缘杂交的不亲和性,获得杂种植株
动物细胞融合
细胞膜的流动性
使细胞分散后诱导细胞融合
除应用植物细胞杂交手段外,再加灭活的病毒诱导
制备单克隆抗体的技术之一
(1)抗体:一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
(2)单克隆抗体的制备过程:
注入小鼠
细胞融合
分离
抗原注入小鼠体内
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
细胞培养
选择培养细胞
培养基
体内培养
体外培养
从腹水提取
从培养液提取
单克隆抗体
(3)杂交瘤细胞的特点:既能大量繁殖,又能产生专一的抗体。
(4)单克隆抗体的优点:特异性强,灵敏度高,并能大量制备。
(5)单克隆抗体的作用:
①作为诊断试剂:准确识别各种抗原物质的细微差异,并跟一定抗原发生特异性结合,具有准确、高效、简易、快速的优点。
②用于治疗疾病和运载药物:主要用于治疗癌症治疗,可制成“生物导弹”,也有少量用于治疗其它疾病。
专题3胚胎工程
1概念、胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术,如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎,还需移植到雌性动物体内生产后代,以满足人类的各种需求。
2、动物胚胎发育的基本过程
(1)精子的发生:补充,精原细胞先进行有丝分裂后进行减数分裂;变形过程中,细胞核为精子头的主要部分,高尔基体发育为顶体,中心体演变为精子的尾,线粒体在尾基部形成线粒体鞘膜,其他物质浓缩为原生质滴直至脱落。[线粒体为精子运动提供能量]
(2)卵子的发生:在胎儿时期,卵原细胞进行有丝分裂演变成初级卵母细胞[被卵泡细胞包围],减一分裂在排卵前后完成,形成次级卵母细胞和第一极体进入输卵管准备受精;减二分裂是在受精过程中完成的。
(3)受精:精子获能(在雌性动物生殖道内);卵子的准备(排出的卵子要在输卵管中进一步成熟到减二中期才具备受精能力);受精阶段[卵子周围的结构由外到内:放射冠、透明带、卵黄膜],a顶体反应:精子释放顶体酶溶解卵丘细胞之间的物质,穿越放射冠。
b透明带反应:顶体酶可将透明带溶出孔道,精子穿入,在精子触及卵黄膜的瞬间阻止后来精子进入透明带的生理反应[它是防止多精子入卵受精的第一道屏障];c卵细胞膜的封闭作用:精子外膜和卵黄膜融合,精子入卵后,卵黄膜会拒绝其他精子再进入卵内的过程[它是防止多精子入卵受精的第二道屏障];精子尾部脱落,原有核膜破裂形成雄原核,同时卵子完成减二分裂,形成雌原核[注意:受精标志是第二极体的形成;受精完成标志是雌雄原核融合成合子]。
(1)受精场所是母体的输卵管。
(2)胚胎发育:a卵裂期:细胞进行有丝分裂,数量增加,胚胎总体积不增加;b桑椹胚:32个细胞左右的胚胎[之前所有细胞都能发育成完整胚胎的潜能属全能细胞];c囊胚:细胞开始分化,其中个体较大的细胞叫内细胞团将来发育成胎儿的各种组织;而滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘;胚胎内部逐渐出现囊胚腔[注:囊胚的扩大会导致透明带的破裂,胚胎伸展出来,这一过程叫孵化];d原肠胚:内细胞团表层形成外胚层,下方细胞形成内胚层,由内胚层包围的囊腔叫原肠腔。[细胞分化在胚胎期达到最大限度]
(三)胚胎工程的应用
(1)卵母细胞的采集和培养:主要方法:用促性腺激素处理,使其排出更多的卵子,然后,从输卵管中冲取卵子,直接与获能的精子在体外受精。第二种方法:从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞;第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。采集的卵母细胞,都要在体外经人工培养成熟后,才能与获能的精子受精。
b精子的采集假***法、手握法和电刺激法;获能对啮齿动物、兔、猪等的精子用培养法(放入人工配制的获能液中);对牛、羊等精子用化学法(放在肝素或钙离子载体溶液中)
(3)受精(属于有性生殖):获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。
(4)胚胎的早期培养:精子与卵子在体外受精后,应将受精卵移入发育培养液中继续培养,以检查受精状况和受精卵的发育能力。培养液成分较复杂,除一些无机盐和有机盐外,还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分,以及血清等物质。当胚胎发育到适宜的阶段时,可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植的时间不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植,小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植,人的体外受精胚胎可在4个细胞阶段移植。)
(1)胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎,或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎,移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内,使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”,接受胚胎的个体称为“受体”。(供体为优良品种,作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。)
地位:如转基因、核移植,或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎,都必须经过胚胎移植技术才能获得后代,是胚胎工程的最后一道“工序”。
(2)胚胎移植的意义:大大缩短了供体本身的繁殖周期,充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。
(3)生理学基础:①动物发情排卵后,同种动物的供、受体具有相同的生理环境,这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。
②早期胚胎在不与母体子宫建立组织上的联系。这就为胚胎的收集提供了可能。
③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。
④受体不会改变外来胚胎的遗传性状
(4)基本程序主要包括:
①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体,有健康的体质和正常繁殖能力的受体,供体和受体是同一物种。并用激素(性激素:孕激素)进行同期发情处理,用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。
②配种或人工授精。
③对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天,用特制的冲卵装置,把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。对胚胎进行质量检查,此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入-196℃的液氮中保存。
④对胚胎进行移植。
⑤移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。
(1)概念:是指采用机械方法将早期胚胎切割2等份、4等份等,经移植获得同卵双胎或多胎的技术。
(2)意义:来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质,属于无性繁殖。
(3)材料:发育良好,形态正常的桑椹胚或囊胚。(桑椹胚至囊胚的发育过程中,细胞开始分化,但其全能性仍很高,也可用于胚胎分割。)
(4)操作过程:对囊胚阶段的胚胎分割时,要将内细胞团均等分割,否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
(二)胚胎干细胞
1、哺乳动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞,来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来。
2、具有胚胎细胞的特性,在形态上表现为体积小,细胞核大,核仁明显;在功能上,具有发育的全能性,可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外,在体外培养的条件下,可以增殖而不发生分化,可进行冷冻保存,也可进行遗传改造。
3、胚胎干细胞的主要用途是:①可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律;②是在体外条件下研究细胞分化的理想材料,在培养液中加入分化诱导因子,如牛黄酸等化学物质时,就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化,这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段;③可以用于治疗人类的某些顽疾,如帕金森综合症、少年糖尿病等;④利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性,移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能;⑤随着组织工程技术的发展,通过ES细胞体外诱导分化,定向培育出人造组织器官,用于器官移植,解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。
专题4生态工程
一、生态工程的概念
生态工程是指应用生态系统中物种共生与物质循环再生原理、结构与功能相协调原则,结合系统分析的最优化方法而设计的促进物质被分层多级利用的生产工艺系统。
二、生态工程的基本原理
生态工程的设计所依据的是生态学和工程学原理
2、工程学原理
(1)物质循环再生原理:物质能在生态系统中循环往复,分层分级利用。我国古代的“无废弃物农业”——利用收集到的一切可能的有机物质转变为有机肥料,改善了土壤结构,培育了土壤微生物,实现了N、P、K等元素的循环利用。
(2)物种多样性原理:生态系统中生物多样性越高,抵抗力稳定性越陷越高,生态系统就越稳定。
(3)协调与平衡原理:要处理好生物与环境的协调与平衡,生态系统中的生物数量不能超过环境承载力(环境容纳量)的限度。太湖等水体富营养化,导致水葫芦和藻类疯长现象;西北衰败的杨树和繁茂的当地树种间的大反差。
(4)整体性原理:生态工程建设,不但要考虑自然生态系统的规律,还要考虑到社会和经济等系统的影响力。只有应用整体性原理,才能统一协调当前与长远、局部与整体、开发与环境建设之间的关系,保障生态系统的平衡与稳定。
(5)系统学和工程学原理:改变和优化系统的结构以改善功能保持很高的系统生产力
三、生态工程建设的基本过程
生态工程在设计时要考虑到有利于人和自然两方面,突出低消耗、多效益、可持续的征。