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课题一微生物的实验室培养
一、培养基分类
培养基分类
划分标准
培养基类型
作用
物理性质
液体培养基
应用于工业或生活生产
半固体培养基
应用于微生物的分离和鉴定
固体培养基
常用于观察微生物的运动及菌种保藏等
成分
人工合成培养基
常用于微生物的分离鉴定
天然培养基
常用于实际工业生产
用途
选择培养基
抑制不需要的微生物生长,促进所需要的微生物的生长
鉴定培养基
根据微生物的特点,在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的,用以鉴别不同类别的微生物
二、培养基的成分
培养基成分
成分
作用
例子
水
碳源
为微生物的代谢提供碳元素的物质
如CO2、NaHCO3等无机碳源;糖类、石油、花生粉饼等有机碳源,异养微生物只能利用有机碳源
氮源
为微生物的代谢提供氮元素的物质
如N2、NH3、NO3-、NH4+(无机氮源)蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨(有机氮源)等。只有固氮微生物才能利用N2
培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如,培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素,培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性,培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性,培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件
三、无菌技术·
控制无菌的目的
控制无菌的操作
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手,进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。
③为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触
·消毒与灭菌的区别
比较项
常用的方法
理化因素的作用强度
消灭微生物的数量
芽孢和孢子能否被消灭
消毒
煮沸消毒法,巴氏消毒法(对于一些不耐高温的液体)还有化学药剂(如酒精、***气、石炭酸等)消毒、紫外线消毒
较为温和
部分生活状态的微生物
不能
灭菌
灼烧灭菌(用于接种环、接种针、试管口等)、干热灭菌(用于玻璃器皿、金属用具等)、高压蒸汽灭菌(用于培养基、无菌水等)、紫外线灭菌法(表面灭菌和空气灭菌等使用)
强烈
全部微生物
能
四、制作牛肉膏蛋白胨固体培养基
(1)方法步骤:计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
(2)倒平板操作的步骤:
(3)倒平板操作的讨论
讨论问题
答案
,需要冷却到50℃左右时,才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度?
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶,感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时,就可以进行倒平板了
为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰?
通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染培养基
平板冷凝后,为什么要将平板倒置?
平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,凝固后的培养基表面的湿度也比较高,将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发,又可以防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。
在倒平板的过程中,如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,这个平板还能用来培养微生物吗?为什么?
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生,因此最好不要用这个平板培养微生物。
五、纯化大肠杆菌
方法
平板划线法
稀释涂布平板法
操作步骤
①将接种环放在火焰上灼烧,直到接种环烧红。②在火焰旁冷却接种环,并打开棉塞。③将试管口通过火焰。④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。⑤将试管通过火焰,并塞上棉塞。⑥左手将皿盖打开一条缝隙,右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内,划三至五条平行线,盖上皿盖。注意不要划破培养皿。⑦灼烧接种环,待其冷却后,从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作,在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。⑧将平板倒置放入培养箱中培养。
①将分别盛有9ml水的6支试管灭菌,并按101到106的顺序进行编号。②用移液试管吸取1ml培养的菌夜,注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移夜管上的橡皮,吹吸三次,使菌液与水充分混匀。③从101倍稀释的试管中吸取1ml稀释液,注入102倍稀释的试管中,重复第二步的混匀操作。以此类推,直到完成最后一支试管的稀释。注意:移夜管需要经过灭菌。操作时,试管口和移夜管应在离火焰1~2cm处
2涂布平板:
①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。②取少量菌液,滴加到培养基表面。③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃,待酒精燃尽后,冷却8~10s。④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面
目的
使聚集在一起的微生物分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落(由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体),以便于纯化菌种
讨论问题
答案
?在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗?为什么?
操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物;每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后,接种环上残留的菌种,使下一次划线时,接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端,从而通过划线次数的增加,使每次划线时菌种的数目逐渐减少,以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环,能及时杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环境和感染操作者
在灼烧接种环之后,为什么要等其冷却后再进行划线?
以免接种环温度太高,杀死菌
在作第二次以及其后的划线操作时,为什么总是从上一次划线的末端开始划线?
划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
问题
答案
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求,想一想,第2步应如何进行无菌操作?
应从操作的各个细节保证“无菌”。例如,酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等
六、菌种的保存
方法
适用的对象
具体操作
临时保藏
频繁使用的菌种
将菌种接种到试管的固体斜面培养基上,在合适的温度下培养。当菌落长成后,将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3~6个月,都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上
甘油管藏
需要长期保存的菌种
在3mL的甘油瓶中,装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中,与甘油充分混匀后,放在-20℃的冷冻箱中保存
课题二土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
一、筛选菌株
土壤中分解尿素的细菌的分离
尿素
尿素是一种重要的农业氮肥,尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后,才能被植物利用。
原理
土壤中的细菌能合成脲酶将尿素分解
所用培养基
选择性培养基(培养基的氮源为尿素,只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素,缺乏氮源而不能生长发育繁殖,而受到抑制,所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物)
配制选择培养基的依据
根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如,培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物;培养基中不加入氮元素,可以选择培养能固氮的微生物;加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等
二、统计菌落数目
(1)直接计数法:常用显微镜直接技术法,一般适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。
(2)间接计数法:常用稀释平板计数法,平板培养基上长出一个菌落就代表原待测样品中一个微生物个体。
当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确,一般设置3~5个平板,选择菌落数在30~300的平板进行计数,并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低,因此,统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
采用此方法的注意事项:~300之间的平板进行计数
三、设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外,其他条件都相同的实验,其作用是比照试验组,排除任何其他可能原因的干扰,证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
四、实验设计
实验设计包括实验方案,所需仪器、材料、用具和药品,具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排
操作步骤
具体操作
原因
土壤取样
距地表约3~8cm的土壤层取样
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长,绝大多数分布在距地表约3~8cm的土壤层取样
样品的稀释
测定土壤中细菌的数量,一般选用104105106
测定放线菌的数量,一般选用103104105
测定真菌的数量,一般选用102103104
保证获得菌落数在30~300之间、适于计数的平板
微生物的培养与观察
培养时间:细菌30~37℃1~2天,放线菌25~28℃5~7天,霉菌25~28℃3~4天
观察:每隔24小时统计一次菌落数目、形状、大小、隆起程度、颜色
四、疑难解答
(1)如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数?
每克样品中的菌落数=(C/V)*M其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml),M代表稀释倍数
注:统计某一稀释度下平板上的菌落数,最好能统计3个平板,计算出平板菌落数的平均值
课题三分解纤维素的微生物的分离
纤维素与纤维素酶
组成
例子
纤维素
一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物,是地球上含量最丰富的多糖类物质
棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物,木材、作物秸秆等也富含纤维素
纤维素酶
由C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶组成,可将纤维素分解成葡萄糖
纤维素在纤维素酶作用下最终被水解成葡萄糖,为微生物的生长提供营养
纤维素分解菌的筛选
方法
原理
刚果红染色法
刚果红+纤维素红色复合物
当纤维素被纤维素酶分解后,刚果红-纤维素的复合物就无法形成,培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样,我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌
分离分解纤维素的微生物的实验流程
流程
注意事项
土壤取样
选择富含纤维素的环境
选择培养
以纤维素为C源,增加纤维素分解菌的浓度
梯度稀释
将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
刚果红染色法:
一种是先培养微生物,再加入刚果红进行颜色反应,另一种是在倒平板时就加入刚果红
挑选产生透明圈的菌落
四、课题延伸
对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后,只是分离纯化的第一步,为确定得到的是纤维素分解菌,还需要进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的测定方法,一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。
五、疑难解答
(1)为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌?
由于生物与环境的相互依存关系,在富含纤维素的环境中,纤维素分解菌的含量相对提高,因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
(2)将滤纸埋在土壤中有什么作用?你认为滤纸应该埋进土壤多深?
将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集,实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。
(3)为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物?
在选择培养的条件下,可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖,而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制,因此可以起到“浓缩”的作用。