文档介绍：上海交通大学
博士学位论文
产紫杉烷类内生真菌的分离及紫杉醇合成相关基因的克隆
姓名:郭宾会
申请学位级别:博士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:唐克轩
20060401
驼鹜����┦垦�宦畚�产紫杉烷类内生真菌的分离及紫杉醇合成相关基因的克隆摘要紫杉烷����类物质是一大类很重要的天然产物,多为~些植烷类物质具有一些独特的生理药效功能,其中,紫杉醇����蛭D�有效地治疗晚期卵巢癌、乳腺癌等多种癌症,目前已成为世界上首选的、最畅销的抗癌药物之一,并且市场出现供不应求的局面。现在,杉中提取的紫杉醇前体巴卡亭��������经化学半合成法人工合杉醇的商业化生产。因此,有必要寻找新的资源和途径来提高紫杉醇的产量,以改善紫杉醇长期供应不足的局面,缓解临床、科研上对紫本研究从两个方面着手,一是通过表面消毒除菌的方法从野生的上,对目前商业上广泛种植的栽培种——曼地亚红豆杉中紫杉醇合成物或真菌的次生代谢产物。因其具有复杂的三环二萜结构,很多紫杉临床和科研上所需的紫杉醇多是从红豆杉植物中提取,或是由从红豆成。但是,天然植物中紫杉醇含量太低且红豆杉资源有限,制约了紫杉醇迫切需要的压力,同时满足广大患者的需求。南方红豆杉中分离产紫杉烷类的内生真菌,并对该类内生真菌做初步的分子遗传学和遗传转化分析,旨在为以后通过微生物发酵培养来生产紫杉醇打下基础和提供备选菌种;二是在本实验室原有的研究基础途径上的重要的关键酶基因��进行克隆、特征分析和功能验证,为以后通过基因工程手段对曼地亚红豆杉进行遗传改良来提高红豆●
;毛.≥幕支童名事博士学位论文杉中紫杉醇及其前体巴卡亭��暮�看蛳录崾档幕�『吞峁┖蜓』�养基、分泌色素、菌落的生长速度、菌丝体以及孢子的特征等,对其�经��、�����瞿谏�婢��攴⒔鸵禾崛∥锝�屑�测,结果表明:在编号为��的内生真菌发酵液提取物中同时检测到紫杉烷类物质������蚑��的存在,所以将其命名为��;��四甲基偶氮唑蓝�笛榻峁��徊奖砻鳎珺�菌株发酵液提取物同紫杉醇标准品一样,都能有效抑制或杀死肝癌细胞系��和肺癌细胞系��肿瘤细胞。根据其生理特性和形态学特征,���晡�一丝状内生真菌,归属于束丝菌属����道的产紫杉烷类物质的内生真菌。�以���昊�蜃镈�和��为模板,同源克隆到了一个细胞色素��家系的紫杉烷类��.羟化酶基因�����.�����捌鋍��験����������T贕���中的���序列比对显示该基因与多种红豆杉属中报道克隆的���腔�富�蛴泻芨叩耐�葱����。通过����杂交分析了该基因在真菌基因组中的拷贝情况,结果表明该主要研究结果如下:�通过表面消毒除菌的方法从野生的南方红豆杉中分离到�个不同的内生真菌菌株;根据分离菌的生理特性和形态学特点,包括培中的�鼍�杲�辛朔掷嗉�ǎ�溆嗑�暧捎谛翁�卣鞑还幻飨陨形�做鉴定。�.��煌�谝郧叭魏伪ǎ�因。������.‘簟靖砷�一‘●‘��』●·“,.
善黟戈鱼名警博士学位论文够被茉莉酸甲酯诱导表达。这是迄今为止关于产紫杉烷类物质内生真�对���杲�辛丝股��潮霉素�舾惺笛椋�⑾殖泵顾�对���甑牧俳缰滤琅ǘ任��/�/�,该浓度可作为对����进行遗传转化的潮霉素筛选浓度。通过正交组合实验,确定了分离��婢���侍宓淖罴衙附庀低澄�.���痸�鼙诿���%�/�蜗牛酶�.���痸�宋�孛���%�/�溶菌酶;用此酶系统在�����侍宓牟�看�.�×��觯痬�敢海欢�附�温度提高到��时,原生质体的产量可达�����个/�酶液。通过荧光素���狨���染色法测定了��婢���侍宓幕钚裕��验材料;分别利用��.��榈嫉脑��侍遄;�透�┡└司�榈�克隆了曼地亚红豆杉中编码�.去乙酰巴卡亭��阴;�R泼傅娜ǔ�������籗����咏环治霰砻鞲没�蚴粲���亩嗷�蚣�基因属于一个多基因家族,符合细胞色素��家系基因特征。通过����杂交初步分析了该基因受外界诱导子茉莉酸甲酯的诱导表达情况,其表达特征与红豆杉中报道的其他基因类似,证明该基因能菌中有关紫杉醇合成相关基因的首次报道。℃条件下酶解�实制备的��婢���示哂懈咝Щ钚裕�梢杂美醋龊笮�;�氖����的菌丝体转化两种方法对���杲�幸糯�;��宰;��件进行了探索,为建立���甑囊糯�;�低澈突竦米;�蚓��打下了基础。�以商业用栽培种曼地亚红豆杉为材料,通过��技术成功族,符合酰基转移酶家系特征;通过���全面分析了该基因受不�●��
����琒�、硫酸铈铵����������琈�】诱导下的表达特完整编码阅读框构建到表达载体后在������了该基因的表达,产生出具有生物活性的�.去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰基转移酶,该酶在体外能够催化底物��ヒ阴0涂ㄍ�