文档介绍：第一军医大学∞玎帮鼬砌靊叫蜘玺瑚鳶岬博士学位论文!!!毛向明论文提交日规基因芯片技术在成年男性精子基因表达谱研究中的应用年墼指导教师姓名马文丽教授单位名称及地址第一军医大学广州同和专称生物化学与分子生物学年论文答辩日期年学位授予单位和日期第一军医大学答辩委员会主席论文评人业名闲分类号密级编号
谱研究中的应用基因芯片技术在成年男性精子基因表达博士研究生:毛向明指导教师:马文丽教授摘要不孕不育是全世界关注的课题。目前每对已婚夫妇中,就有对夫妇存在不孕不育问题。其中男性因素占到了%。也就是说,男性精子质量不佳,己影响到人类的繁衍生息。引起精子质量不佳的原因很多,长期以来人们进行了多方面的研究,但病因和发病机制都不是十分明确,临床治疗效果也不尽如人意。男性精子质量不佳,从而引发的男性不育,成为困扰临床的难题之一。从分子水平探明影响精子质量的因素,以便采取有针对性的诊断、治疗措施,提高精子质量,提高人类生育力,具有重要的理论和现实意义。遗传学的发展提示我们“人类的疾病或多或少与基因有关”,男性精子质量不佳也应是如此。因此,我们试图从基因的水平来解释男性精子质量不佳的原因,以期能够对临床采取有针对性的、更有效的诊断、治疗措施,提供理论上的支持和指导。从基因的水平阐述疾病的致病机制,可以有两个途径。一是从基因组耐暾浴⒄沸匀手,研究精子基因组欠翊嬖贒碱基序列的大片段缺失,或出现罨哪承┪坏愦Φ耐槐洹⑷笔У取A硪环矫嬖蚴亲叛塾诨因的表达,因为人类有备黾罨裕ń鼋霰泶万个左右的蛋博士学位论文基因芯片技术在成年男性精于基因表达谱研究中的应用
——胍/有机溶剂的抽提方法,并排除了各种可能造成廴疽蛩兀素土字福吡L逯械溺晁嵬亚饷福送饣褂蠳、酶、白质,显然基因组写罅看嬖诘氖且恍┓潜泶镄蛄校蛑馗葱蛄校仅有一小部分蛄惺蔷哂斜嗦牍δ艿男蛄校堑谋泶锊锏牧和质显然更具有决定性的作用。所以,我们也把精子中具有编码功能的序列作为重点,把精子的基因表达谱作为研究对象。要研究精子的基因表达,首要的问题是提取到精子中表达的精子与体细胞不同,是单倍体细胞,处于分化的终末阶段,因此,以前人们一直认为精子中无基因表达,精子基因分子生物学的研究也一直没有深入开展。直到最近几年,热耸紫缺ǖ懒嗽诰子内检测到了谋泶铮撕驧热讼群蟾慕艘炝蚯馑成人的精子中分离到了胖な盗顺墒炀又腥肥荡嬖赗的表达。随着对精子分子生物学研究的不断深入,精子中有基因表达也越来越得到人们的认同,如顶体中的水解蛋白酶该髦仕崦福ヌ酪氨酸蛋白激酶、尿激酶、乳酸脱氢酶等等。这些发现和认识激发了人们进一步研究精子基因表达的浓厚兴趣。提取细胞或组织中的炝蚯杷犭曳ㄒ恢笔谴扯涞姆法,对大多数的细胞和组织都能得到良好的结果,但在提取精子中的保Ч⒉焕硐搿精子是单倍体细胞,比之体细胞,谋泶锸喽陨佟W魑7化末期状态细胞,谋泶锪靠赡芤灿兴档停宰芴宥裕子中的拷险L逑赴偷枚唷针对这种特殊的实验材料,本实验对奶崛〕绦蚪辛颂索。选择了究7⒌摹⒄攵孕⊙妨康腞提取试剂盒刺崛〕赡昴行曰盍φ5木覴,取得了良好的效果。对提取到的诮心孀B记靶杞兄柿考觳猓匀繁C挥谢因组廴尽Sτ贸9娴哪旱缬炯觳馓崛〉降纳倭康木覴,无法在电泳结果中看到械娜鹾颂翘錜条带,也无法根据中文摘要
收集的精子探针的准确性和可信性;②对精子的基因表达进行常规的条带间的灰度比值,来判断形藿到饣虼嬖贒污染。针对这个问题,我们应用了微流体芯片高压凝胶电泳进行了质量检测。在极少量的上样检测中⑾至薘中的三个核糖体条带,但与正常体细胞的缬就计撞灰恢隆T谌狈Ρ曜寂卸现副的前提下,根据重复多次的实验结果,提出了精子泳图谱的基本形状,及精子柿科兰鄣幕颈曜肌进而,我们将经过质量检验的精子孀B嘉猚τ寐文丽、郑文岭教授创建的限制性显示技术,对进行了限制性酶切、加通用接头,用通用引物进行┰觯ɡ┰霾镒魑D0澹搜由煲桓黾罨耐ㄓ靡镂7肿橐锝辛耸镻分组扩增,并将十组镒H氪蟪Ω司堪濉⑻艨寺⒓ā⑻崛⊙粜质粒等操作,收集到了鼍觕钠危嗪潘饕℃保存备用。将质粒中保存的精子片段,根据质粒上的序列设计引物,扩增插入的精子片段。上述片段扩增并达到足够量后甮异丙醇纯化,纯化产物重溶于猀超纯水中,取出适量,加入%,调整浓度为/“贑的玻片上,以涣姿岣油醛Q粜远哉眨琀基因片段为阴性对照,%甲基亚砜为空白对照,每个探针重复打印三次,制作了精子表达谱基因芯片。应用自制的精子芯片进行了两个方面的研究。④验证我们了初步的研究。精子样品按上述同样的方法和操作程序进行限制性显示实验操作,但在片段的两端连接上了与探针序列不一样的通用接头儆孟嘤Φ耐ㄓ靡扩增,避免杂交时,探针和待杂交样品间都具有大约的同源性片段,从而对杂交结果的准确性造成影响。经此法制备的精子片段,用ü馕镏时昙呛螅男酒罅薪辛说ド咏唬咏唤峁な滴颐鞘占木探针具有较好的准确性和可信性,可进行进一步的杂交实验和分