文档介绍：该【常规病毒学实验技术 】是由【世界末末日】上传分享，文档一共【15】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【常规病毒学实验技术 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。常规病毒学试验技术
〔一〕病毒的培育
试验动物:家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠主要用于:
①分别病毒,并借助感染范围试验鉴定病毒
②培育病毒,制造抗原和疫苗
③测定各毒株之间的抗原关系,〔用试验动物作中和试验和穿插保护试验〕
④制备免疫血清和单克隆抗体
⑤作病毒感染的试验争辩,包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等
留意:选择对目的病毒敏感的试验动物品种品系,以及适宜的接种途径和剂量。
鸡胚
〔一〕条件要求
SPF鸡、孵化温度38-39℃,湿度40-70%,通风。颖受精卵:产下后不超过10天并保存10℃左右。
〔二〕优点
组织分化程度低,可选择不同的日龄和接种途径,病毒易于增殖,感染病毒的组织和液体中含有大量病毒,简洁采集和处理,而且来源充分,设备和操作简便易行。
〔三〕接种途径
绒毛尿囊膜接种〔10-12日龄鸡胚〕
主要用于痘病毒和疱疹病毒的分别和增殖。1〕方法一〔造人工气室〕
①在胚胎四周近气室处,选择血管较少的部位,用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。
②用碘酊和酒精消毒后,留神用刀尖撬起卵壳,造成卵窗。
③在气室端中心钻一个小孔。
④用针尖挑破卵窗中心的壳膜,切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。
⑤滴加滴生理盐水于刺,用橡皮乳头紧贴于气室中心小孔上吸气,造成气室内负压,使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形***工气室,此时可见滴于壳膜上的生理盐水快速渗入。
⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
⑦用透亮胶纸封住卵窗,或用玻璃纸盖于卵窗中,四周涂上熔化的石蜡密封,气室中心的小孔用石蜡密封。
⑧鸡胚横卧于卵箱中,不许翻动,保持卵窗向上。2〕方法二
①×。
②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。
③滴入接种物。
④用透亮胶纸封闭开口。
尿囊腔接种〔10-11日龄〕
用于正粘病毒和副粘病毒〔NDV〕
画出气室和胚位
在气室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒
用钢锥穿一小孔
-1cm,注入接种物
用石蜡封口,置孵卵箱中孵育,每天翻卵1-2次
卵黄囊接种〔6-8日龄〕
主要用虫媒病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分别和增殖。1〕画出气室和胚位
垂直放置在卵座上,用碘酊和酒精消毒气室外端
以钢锥在气室中心锥一小孔
将注射器针头沿此小孔插入3cm,注入接种物
用石蜡封口,置孵卵箱中孵育,每天翻卵1-2次
其它接种途径
羊膜腔接种,正粘病毒和副粘病毒静脉接种,蓝舌病毒
脑内接种,狂犬病毒
组织培育
原代细胞:应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液,适当洗涤以后,参加养分液,通常即可使其贴附于玻璃壁上,并生长增殖。
继代细胞:将原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来再作培育。
传代细胞:由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下,组织培育细胞中有时消灭恶性变细胞,也就是癌变细胞,这种病变细胞具有很高的增殖势能,而且几乎可以无限地传代。
原代细胞培育〔以鸡胚成纤维细胞为例〕
在无菌条件下实行9-10日龄鸡胚,置灭菌平皿中,除去头〔或仅除去喙和眼〕、爪和内脏,并剪成块。
用Hanks液,充分冲洗后移入大号青霉素瓶或其它广口瓶中,用眼科剪剪成1mm3大小的碎块。
参加Hanks液,充分冲洗,并静置几分钟,待组织块下沉,吸弃上层液体,再加洗液。如此反复冲洗2-3遍。
%胰酶,-,振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟,每10分钟轻轻摇动一次。
取出,留神吸弃上层胰酶溶液,用洗液轻洗2次后,用大口径吸管反复吹打,使细胞游离。
用双层或三层纱布过滤,收集滤液于离心管中,以600rpm离心沉淀5-10min,吸弃上清液,按每个鸡胚5ml的量,参加养分液,并用吸管反复吹打,直至形成均匀的细胞悬液。
细胞计数〔培育时,使细胞到达5×105个/ml〕
+%结晶紫——构椽酸〔〕溶液,室温或37℃温箱中5-10分钟,充分振荡后进展计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数〔N〕。每ml悬液中的细胞数〔n〕=N/4
×10000×K〔稀释倍数〕。
传代细胞系培育
优点:1)可以无限的传代。
不少细胞系对病毒很敏感。
某些传代细胞系能在悬浮培育条件下培育,适合病毒抗原的大量生产。
生长旺盛,生殖快速,对养分条件不苛刻。缺点:在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。
细胞分散剂
胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解,导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
乙二***四乙酸二钠〔EDTA〕养分液
人工综合养分液
氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、关心生长因子。
血清
动物血清中含有细胞生长所必需的各种养分因子。
促进细胞的贴壁和生长。
具有很强的酸碱缓冲作用。
〔二〕病毒感染力的滴定
LD,EID,TCID
的测
〔
定〕
50TCID50 50
50
在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释,从10-1—10-10。
将稀释好的病毒接种到96孔微量培育板中,每一稀释度作8孔,每孔接种100ul。,使细胞量到达3×105个/ml。,正常细胞比照作两纵排。,一般需要观看5-7天。
,按Reed-Muench两氏法或Karber法进展。
TCID的计算方法:
50
Reed-Muench法
病毒液
消灭 累计 出CPE的孔
稀释度
CPE孔
不消灭CPE孔
消灭CPE孔
不消灭CPE孔
所占的%
10-1
8
0
27
0
100〔27/27〕
10-2
8
0
19
0
100〔19/19〕
10-3
7
1
11
1
(11/12)
10-4
3
5
4
6
40〔4/10〕
10-5
1
7
1
13
〔1/13〕
10-6
0
8
0
21
0〔0/21〕
高于50%的百分数-50%
-50
距离比例= = =
高于50%的百分数-低于50%的百分数 -40
lgTCID50=距离此例X稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数
=×(-1)+(-3)=-
TCID=10-
50
Karber法
病毒液稀释度 消灭CPE孔的比率
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
lgTCID=L-d(s-)
50
L:最高稀释度的对数D:稀释度对数之间的差S:阳性孔比率总和
8/8=1
8/8=1
7/8=
3/8=
1/8=
0/8=0
lgTCID50=-1-〔-1〕×(-)
=-
TCID50=10- 〔三〕病毒中和试验
一、原理
抗体与相应的病毒粒子特异性地结合,使后者丧失感染力量。
二、用途
疾病诊断。
病毒分别株的鉴定。
不同病毒株的抗原关系争辩。
疫苗免疫原性的评价。
免疫血清的质量评价。
测定试验动物血清中是否存在抗体等。
三、分类
〔一〕终点法中和试验
固定病毒——稀释血清法。
将测好TCID50的病毒稀释成200个TCID50的病毒悬液。
在96孔微量培育板中将血清作连续倍比稀释〔具体方法是在96孔板中先参加50ul生长液,再加50ul待检血清,混匀后,吸50ul至下一孔,如此下去。始终到1:256〕,每个稀释度作4孔。
在上述各孔内参加50ul稀释好的病毒液,混匀后放入37℃5%CO2培育箱中作用
45min-60min。
同时设待检血清毒性比照,阴、阳性血清比照,病毒比照和正常细胞比照。
感作完成后每孔参加100ul细胞悬液,放37℃5%CO2培育箱培育,逐日观看并记录结果。
结果计算,按Reed-Muench两氏法或Karber法进展。
Reed-Muench计算方法:
血清稀释度 CPE孔数
无CPE孔数
CPE孔数
累
计
无CPE孔数
保护率〔%〕
1:4〔10-〕 0
4
0
9
100
1:16〔10-〕 1
3
1
5
83
1:64〔10-〕 2
2
3
2
40
1:256〔10-〕 4
0
7
0
0
1:1024〔10-〕 4
0
11
0
0
距离比例=
高于50%的保护率-50%
高于50%的保护率—低于50%的保护率
83-50
= =
83-40
高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数
=-+×(-)
=-
-=1/46
即:1:46稀释的待检血清可保护50%的组织培育细胞免于消灭CPE。
固定血清——稀释病毒法。
1)将病毒作连续10倍稀释
将稀释好的病毒接种96孔板,每个稀释度接种一纵排共8孔,每孔50μl,做两块板子,在一块板子的每孔参加50μl待检血清〔试验组〕,另一块板子的每孔参加50μl正
常血清〔比照组〕,混合后置37℃5%CO培育箱作用1h。
2
然后在每孔中参加100μl细胞。
另外还设两纵排正常细胞比照。
置37℃5%CO培育箱培育,逐日观看并记录结果。
2
50
分别计算每组病毒的TCID,然后计算血清的中和指数。
中和指数=
试验组TCID
50
比照组TCID
50
(二)蚀斑〔痘斑〕减数试验
1、蚀斑技术
病毒蚀斑:又称空斑,指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。
原理:将病毒悬液作连续的10倍稀释,随后各取定量,接种于已经长成单层的敏感细胞上,并掩盖中性红琼脂糖,待其消灭蚀斑后计数,即可算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑单位。
用途:①用于病毒纯化;②测定病毒悬液中感染病毒的含量。2、蚀斑减数试验
将病毒——正常血清混合物以及病毒——待检血清混合物分别接种到单层细胞上,随后掩盖养分琼脂或***纤维素,进展蚀斑测定,比较病毒——正常血清组和病毒——待检血清组产生的蚀斑数,两者的差数表示待检血清的中和力量。以试验组的蚀斑数比比照组削减50%作为判定依据,血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
(三)穿插保护试验
先将试验动物进展主动免疫或被动免疫,然后以待检病毒进展攻击,依据试验动物被保护的状况,判定待检V的种类或型别。其缺点是试验周期太长,并且需要大量的试验动物。用途:〔1〕应用V鉴定未知V
应用免疫血清鉴定未知V
应用V鉴定未知血清
病毒材料的注备
〔四〕病毒的分别和鉴定
脑、肝、肌肉等器官或组织
充分研磨后参加5倍量的Hank’s液〔〕反复冻融三次。2023rpm10min,取上清作接种物。
鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物
用内含青、链霉素100u/ml的Hank’s液,将其稀释3-5倍,充分混匀悬浮后,置4℃冰箱内感作2-4h或过夜,200rpm10min取上清作接种物。
咽喉拭子或鼻拭子
认真用棉拭子擦拭咽喉部,并快速将其泡入盛有2-5mlHank’s液的〔200-500u/〕试管内,充分涮洗棉拭子,反复冻融3-5次,收集液体局部,2023rpm10min,收集上清作接种物。
粪便
用含100u/’s液作10-20倍稀释,4℃感作4h,2023rpm10min取上清作接种物。
无菌的体液或鸡胚液直接接种用。
接种方法
试验动物
鸡胚
目前常用鸡胚分别的病毒有正粘V、副粘V、痘V、脑炎V及引起禽类疫病的其它很多V。
组织培育细胞。
病毒增殖的判定
细胞病变〔CPE〕
抗原的测定
中和试验
病毒间的干扰现象
乙型脑炎V 脊髓灰质炎V
流感V 西方马脑炎V
猪传染胃肠炎 牛病毒性膜炎 粘膜病V
电子显微镜观看
试验动物或鸡胚接种
病毒感染力的滴定
LD、EID、TCID
50 50 50
病毒理化学特性的测定
病毒核酸型鉴定〔药物抑制试验〕FUDR、IVDR、BRUDR
原理:FUDR、ICDR、BRUDR是嘧啶的卤化物,进入cell后发生磷酸化,掺入合成的DNA以代替胸腺嘧啶产生至功能分子,从而抑制DNA的合成。常用浓度为50ug/ml。
脂溶剂敏感性试验
***敏感试验
取同批病毒分装于两个青霉素瓶中,每瓶16ml,在其中1瓶参加麻醉用***,使终浓度为20%,两瓶均用橡皮塞塞紧后,置4℃冻箱内作用24h,其间不时振荡,随后以2023rpm离心20min。已加***的小瓶,用毛细吸管吸取病毒液,移入另一小瓶内,适当吹打,使残
余***挥发殆尽,然后滴定两组病毒的TCID。
50
***仿敏感性试验
向病毒液内参加分析纯***仿,%,置4℃振荡混合10min。随后500rpm5min,然后吸取上层液体,滴定病毒TCID。%的生理盐水,同
50
样处理和滴定。
脊髓灰质炎V、猪传染性胃肠炎V对胰酶有较强的抵抗力,痘V、呼肠孤V、疱疹V易被胰酶灭活。取病毒液两瓶,每瓶1ml,在其中1瓶参加1ml1%的trypsin,%,另一瓶参加1ml1640〔培育基〕,用橡皮塞塞紧瓶口,将小瓶倒转几次,使其充分混合,置37℃1h,随即参加灭活犊牛血清8ml,充分混合,终止胰酶的作用。最终滴定两瓶V的TCID50。
耐酸性试验
取等量病毒液两瓶,(),并在另一个小瓶内参加一样于用酸量的培育基作为比照,置37℃水溶或室温中感作2h(or
1h),%NaHCO
3
,比照组再加紧入一样于NaHCO
3
量的培育
基,测定两者的TCID50。
耐热性试验
将病毒液分成等量的11小瓶,其中4小瓶分别置50℃、60℃、70℃、80℃水溶中1h,另6瓶置50℃水浴中分别感作5、10、15、30、60和180min,随后测定每瓶V的感染X。
病毒粒子大小测定
电子显微镜直接观看〔透射电镜、磷钨酸负染〕
超速离心沉淀
滤过试验
取澄清的病毒液20ml,留出1ml作为比照,将剩余的19ml病毒液在正压下依次通过孔经为450nm、225nm、100nm和50nm的各级微孔,每通过一种孔径的滤膜就吸取1ml滤液用
为样品,并将剩余的滤液通过一次滤膜。最终测定原病毒液以及各级滤液的TCID。
50
病毒液种类 TCID/
50
滤前病毒液
10-
450nm孔径液
10-
225nm孔径液
10-
100nm孔径液
10-
50nm孔径液
10-
免疫——血清学检查
目的:①分别毒株的种类及型别的鉴定。
②检测发病动物体液中的Ab,或进一步比较动物急性发病期和恢复期血清中的Ab效价,了解病毒性Ab是否有明显的增长,从而判定V感染的存在。
〔一〕中和试验
终点法中和试验
固定病毒——稀释血清法中和试验固定血清——稀释病毒法中和试验
蚀斑〔痘斑〕减数试验1〕蚀斑技术
病毒蚀斑,又称空斑,指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。
原理:将病毒悬液作连续的10倍稀释,随后各取定量,接种于已经长成单层的敏感细胞上,并掩盖中性红琼脂糖,待其消灭蚀斑后计数,即可算出病毒悬液中每毫升所含的蚀斑单位。
用途:①用于病毒纯化;②测定病毒悬液中感染病毒的含量。2〕蚀斑减数试验
将病毒——正常血清混合物以及病毒——待检血清混合物分别接种到单层细胞上,随后掩盖养分琼脂或***纤维素,进展蚀斑测定,比较病毒——正常血清组和病毒——待检血清组产生的蚀斑数,两者的差数表示待检血清的中和力量。以试验组的蚀斑数比比照组削减50%作为判定依据,血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
穿插保护试验
先将试验动物进展主动免疫或被动免疫,然后以待检病毒进展攻击,依据试验动物被保护的状况,判定待检V的种类或型别。其缺点是试验周期太长,并且需要大量的试验动物。用途:〔1〕应用V鉴定未知V;
应用免疫血清鉴定未知V;
应用V鉴定未知血清。
〔五〕凝集试验
定义:
颗粒性抗原〔如细菌、红细胞等〕或外表载有抗原的颗粒状的物质〔如聚苯乙烯胶乳、
红细胞、炭素颗粒等〕,与相应抗体在电解质存在下凝集成团的试验。
分类
直接凝集试验:颗粒状Ag与相应Ab所发生的凝集反响。〔布氏杆菌〕
间接凝集试验〔被动凝集试验〕:可溶性抗原吸附到载体颗粒外表,与相应抗体所发生的凝集反响,可以证明相应抗体的存在并测定效价。反相问接凝集试验〔反向被动凝集试验〕:将抗体吸附到颗粒外表与相应抗原所发生的凝集反响。
间接血凝试验胶乳凝集试验
炭凝集试验 间接凝集试验皂土凝集试验
脂质体凝集试验
间接凝集抑制试验:先将被检的抗体〔或抗原〕与的抗原〔或抗体〕作用后,再与抗体〔或抗原〕致敏的颗粒时行反响。
反向凝集抑制试验
间接凝集试验的优点:快速、简便、特异、敏感
间接血凝试验〔IHA〕〔PHA〕
口蹄疫、猪瘟、弓形体、胸膜肺炎、衣原体
反向IHA:FMDV、水疱病病毒Ag、猪传染笥胃肠炎病毒Ag、小鹅瘟病毒Ag等。红细胞作为载体的优点:
来源广泛,简洁取得。
红细胞外表几乎可以吸附任何一类的Ag或Ab,如蛋白质、糖蛋白、核蛋白以及多糖等。
具有自然的均一性,比其它很多载体都更简洁标准化和规格化。缺点:简洁裂开、难于保存
IHA的优点:
①敏感性高、特异性强、重复性和稳定性好,操作简便、反响快速。
②既可定性又可半定量,而且试剂价格低廉,不需要特别、简单的设备。
留意:影响红细胞凝集的因素很多:红细胞的来源,致敏条件、操作技术、标本中的杂质、细菌污染和类属Ag常引起非特异性凝集反响。
红细胞的选择和保存
选择:很多种类动物的红细胞,包括人的0型红细胞都可用,但用得最多的是绵羊红细胞。保存:用玻璃珠脱纤法采集或用肝素抗凝。
②无菌的红细胞在4℃冰箱中可保存3-4天。
②采血时加等量氏液和适量抗生素,4℃保存2周,但这样红细胞致敏时容液自凝。
红细胞的醛化
醛化剂:甲醛、戊二醛、***醛、***醛—甲醛双固定、戊二醛—***醛双固定。
无菌实行绵羊静脉血,加至红细胞保存液内,4℃保存备用。
取红细胞悬液1份,、〔〕,洗5遍,并以该液配成8%红细腻悬液。
红细胞悬液1份+3%***醛液等量,24左右的室温中用电磁搅拌器缓慢搅拌17h。%悬液,——***醛固定红细胞悬液。
***醛固定红细胞悬液1份+等量3%甲醛液,如上搅拌17hr。
,%%的红细胞悬液,分装后置4℃冰箱内保存,可用2个月—双醛化红细胞悬液。
红细胞的鞣化
作用:可增加红细胞吸附蛋白质的力量,颖红细胞用1:202300浓度的鞣酸,醛化红细胞用1:100000浓度的鞣酸。
程序:取红细胞,—5遍,%悬液,:202300优质鞣酸,将其与红细胞悬液等量混合,37℃水浴咸作15min。,%红细胞悬液。
致敏红细胞的制备:
抗体致敏红细胞
取20%鞣化或未鞣化的双醛化红细胞悬液1ml,离心沉淀,弃去上清液,.5~,参加等量的提纯IgG液〔每毫升需含IgG100~300g〕置37℃水浴中咸作2-4h,每15-20分钏用吸管轻轻吹吸混合2-3次。,再将沉淀红细胞用1%%悬液备用。——Ab致敏红细胞悬液。
抗原致敏红细胞
取PBS〔〕4ml病毒抗原1ml,%鞣酸化红细胞悬液1ml,混匀后,置室温下振荡结合30—60min〔随病毒Ag种类不同〕或37℃水浴30-45min,其间适当振摇。随后以1500rpm离心沉淀10min,(内含1%灭活兔血清)洗2遍后,配成1%的致敏红细胞悬液供试验用。以病毒致敏的红细胞悬液应马上使用。4℃冰箱保存,不宜超过2天。
※致敏红细胞的保存:用1%%明胶缓冲液洗涤,%悬液保存备用。长期保存:用含1%糖和4%兔血清的生理盐水,将致敏红细胞配成10%悬液,然后于真空中冷冻枯燥。
乳胶凝集试验
乳胶的预处理
取空白乳胶用PBS〔〕配成2%溶液,参加10%的胰蛋白酶液,使其终浓度为1%,于56℃水溶作用18-24h,其间摇动几次,置4℃冰箱保存备用——使乳胶稳定并削减非特异性凝集。〔离心上清,将沉淀用PBS悬浮配成2%乳胶溶液〕
乳胶的致敏
将浓缩的病毒抗原作倍比稀释〔PBS〕,参加等量的2%空白乳胶中〔逐滴参加,边加边摇动〕。37℃作用15-30min。
参加10%牛血清白蛋白,使终浓度为1%,混合均匀,37℃15-30nin,或2h,即得乳
胶抗原。
〔六〕标记抗体技术〔免疫标记技术〕
原理:抗体能追踪抗原,在抗原所在部位与之结合,一旦结合后就不易洗脱。但此种结合反响肉眼不易察出。有一些物质在超微量时,即能用某种特别理化因素将其检测出来。如将这些构标记在抗原或抗体分子上,就能利用调换体与原特异结合的特性,检测抗原或抗体,即免疫标记技术。
荧光抗体技术〔免疫荧光技术〕分类:酶标记抗体技术〔免疫酶技术〕