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临床与病理杂志
2022,42(7)
JClinPatholRes1513
doi:.2095-·论著·
Viewthisarticleat:/-
MiR-146b通过靶向TRAF6减轻狼疮性肾炎 
肾小球系膜细胞的损伤
林梅,宋丹,黄月桂
[中国科学院大学深圳医院(光明)肾内科,广东深圳518000]
[摘 要]目的:研究微RNA-146b(microRNA-146b,miR-146b)对狼疮性肾炎小鼠肾小球系膜细胞增殖、
炎症因子分泌以及细胞周期的影响及其潜在机制。方法:采用双荧光素酶报告基因实验验证
miR-146b和肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor6,
TRAF6)的靶向关系;实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测TRAF6蛋白的表达
水平;将肾小球系膜细胞分为miR-control组(转染miR-146b模拟物阴性对照)、miR-146bmimic组
(转染miR-146b模拟物)、miR-146bmimic+NC组(共转染miR-146b模拟物和空载质粒pcDNA-NC)
和miR-146bmimic+TRAF6组(共转染miR-146b模拟物和TRAF6过表达质粒);采用细胞计数试剂
盒8(CCK-8)和免疫荧光染色法检测细胞增殖;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中
炎症因子的水平;流式细胞术分析细胞周期。结果:MiR-146b靶向结合TRAF6并负调控TRAF6
的表达。与miR-control组比较,miR-146bmimic组细胞的增殖能力显著减弱,细胞培养上清液中
炎症因子白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因
子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)的水平降低,细胞发生G0/G1期阻滞;过表达TRAF6显著逆
转了miR-146b对肾小球系膜细胞增殖和炎症因子分泌的抑制作用,减少G0/G1期细胞占比,促使
细胞进入S期。结论:MiR-146b可能通过靶向TRAF6减轻狼疮性肾炎肾系膜细胞的炎性损伤。
[关键词]狼疮性肾炎;肾小球系膜细胞;微小RNA-146b;肿瘤坏死因子受体相关因子6
MiR-146balleviatesglomerularmesangialcelldamagein
lupusnephritisbytargetingTRAF6
LINMei,SONGDan,HUANGYuegui
[DepartmentofNephrology,UniversityofChineseAcademyofSciences,ShenzhenHospital(Guangming),ShenzhenGuangdong518000,China]
AbstractObjective:ToinvestigatetheeffectsofmicroRNA-146b(miR-146b)ontheproliferation,secretionof
inflammatoryfactors,andcellcycleofmesangialcellsinmicewithlupusnephritisanditspotentialmechanism.
Methods:ThetargetingrelationshipbetweenmiR-146bandtumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor
6(TRAF6)-timequantitativepolymerasechainreaction
收稿日期(Dateofreception):2021–07–27
通信作者(Correspondingauthor):林梅,Email:******@
基金项目(Foundationitem):光明区经济发展专项资金(2020R01017)。ThisworkwassupportedbytheSpecialFundforEconomicDevelopmentin
GuangmingDistrict,China(2020R01017).
1514临床与病理杂志,2022,42(7)
(qRT-PCR)
amiR-controlgroup(negativecontroltransfectedwithmiR-146bmimic),amiR-146bmimicgroup(transfected
withmiR-146bmimic),amiR-146bmimic+NCgroup(co-transfectedwithmiR-146bmimicsandempty
plasmidPCDNA-NC)andamiR-146bmimic+TRAF6group(co-transfectedwithmiR-146bmimicsand
TRAF6overexpressionplasmid).Cellcountingkit8(CCK-8)andimmunofluorescentstainingwereusedto
-linked
immunosorbentassay(ELISA).:MiR-146btargetedand
-controlgroup,theproliferationabilityofcells
inmiR-146bmimicgroupwassignifcantlydecreased,thelevelsofinfammatoryfactorsinterleukin1β(IL-1β),
interleukin6(IL-6)andtumornecrosisfactorα(TNF-α)incellsupernatantweredecreased,andthecellswere
arrestedinG0/-146bonthe
proliferationandsecretoryofinfammatoryfactorsinmesangialcells,reducedtheproportionofG0/G1phasecells,
:MiR-146bmayalleviatetheinfammatorydamageof
mesangialcellsinlupusnephritisbytargetingTRF6.
Keywordslupusnephritis;glomerularmesangialcell;microRNA-146b;tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor6
系统性红斑狼疮是一种以免疫系统异常活化究所提供,体重45~55g,鼠龄10~12周;人胚
和自身抗体异常增多为特征的自身免疫性疾病,肾细胞株HEK-293T购自中国科学院上海细胞
全身多个器官受累,严重危害人类健康[1]。狼疮性库;DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公
肾炎是系统性红斑狼疮最常见的并发症之一,也司;miR-146b模拟物(miR-146bmimic)和阴性对
是影响患者预后的关键危险因素[2]。狼疮性肾炎的照(miR-control)、TRAF6过表达质粒(pcDNA-
发病机制目前尚不清楚。肾小球系膜细胞异常增TRAF6)和空载质粒(pcDNA-NC)、RIPA裂解
殖及炎症性因子过度分泌是狼疮性肾炎的重要病缓冲液均购自上海生工生物公司;TRIzol试剂
理特征[3]。因此,探究调控肾小球系膜细胞炎性损购自美国Invitrogen公司;Quantitec反转录试
伤的机制对于明确狼疮性肾炎的发病十分重要。剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;SYBR
微RNA(microRNAs,miRNAs)是一类小的内源GreenRealTimePCR试剂盒购自德国QIAGEN
性非编码RNA,在转录后水平调控基因的表达。公司;各基因引物购自上海吉凯基因医学科技
研究发现miR-146b在多种人类疾病中发挥关键作股份有限公司;CCK-8试剂盒、ELISA试剂盒
用[4],且过表达miR-146b可以抑制狼疮性肾炎小鼠购自上海翊圣生物科技有限公司;荧光素酶活
肾小球系膜细胞增殖,降低炎症因子水平[5]。然而性检测试剂盒购自美国Promega公司;Annexin
miR-146b对狼疮性肾炎肾小球系膜细胞周期调控作V-FITC/PI双染试剂盒、ECL化学发光试剂盒均
用及下游机制尚不清楚。既往研究[6]表明:肿瘤坏购自美国赛默飞世尔公司;一抗和二抗均购自
死因子受体相关因子6(tumornecrosisfactorreceptor-武汉博士德生物公司。
associatedfactor6,TRAF6)在狼疮性肾炎患者外周
血和狼疮小鼠肾组织中显著上调,
肾炎的发病。然而,
调的机制尚不清楚。本研究旨在探讨miR-146b靶向采用断颈法处死MRL/faslpr小鼠,参考文献[4]
TRAF6对狼疮性肾炎小鼠肾小球系膜细胞增殖、炎分离和培养小鼠肾小球系膜细胞。将肾小球系膜
症因子以及细胞周期调控的作用。细胞置于DMEM培养基中培养,并向培养基中添
加10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素,培养环境
1材料与方法为37℃,5%CO2。待细胞生长至80%融合时,进
行传代。取第3~6代的细胞进行实验。本研究经中
(光明)医学伦理委员会批准
雄性MRL/faslpr小鼠由南京大学动物模式研()。
MiR-146b通过靶向TRF6减轻狼疮性肾炎肾小球系膜细胞的损伤林梅,等1515
-67表达
取对数生长期肾小球系膜细胞,以每孔取对数生长期的肾小球系膜细胞接种于12孔
2×105个细胞接种于6孔板,待细胞生长至融合度为板,加入Ki-67一抗,于4℃孵育过夜,PBS清洗
50%~60%,严格按照Lipofectamine2000说明书进后使用荧光二抗于37℃孵育1h,PBS清洗3次,加
行转染。DAPI避光孵育5min,随后在荧光显微镜下拍照。
将肾小球系膜细胞分为:1)miR-control组,
染miR-control;2)miR-146bmimic组,转染miR-146b采用ELISA试剂盒,根据说明书进行操
mimic;3)miR-146bmimic+NC组,共转染miR-146b作,分别检测各组细胞培养液上清中白细胞
mimic和pcDNA-NC;4)miR-146bmimic+TRAF6组,介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素
共转染miR-146bmimic和pcDNA-TRAF6。6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor
-146b与necrosisfactor-α,TNF-α)的水平。将各组细胞上清
TRAF6靶向关系液和不同浓度标准品分别加入酶标板中。于37℃
构建含野生型(TRAF6-3'UTR-WT)和突变型孵育2h,-1β、IL-6和
(TRAF6-3'UTR-MUT)荧光素酶报告基因质粒,并TNF-α抗体工作液,于37℃培养箱中反应1h。加
分别与miR-control和miR-146bmimic共转染至HEK-,继
293T细胞,命名为miR-control+TRAF6-WT组、miR-续在37℃反应30min,依次加入TMB显色液,于
146bmimic+TRAF6-WT组、miR-control+TRAF6-37℃避光反应30min,,采用全
MUT组以及miR-146bmimic+TRAF6-MUT组。转染自动酶标仪于450nm波长处测定吸光度(A值)。
48h后,
胞萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。使用AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒检测细胞
。收集各组处理好的细胞,使用PBS洗涤两次
表达后重悬细胞,调整为5×105个/mL的细胞悬液。取
使用TRIzol试剂提取细胞总RNA,然后用100μL细胞悬液,1000r/min离心弃去上清液,
Quantitec反转录试剂盒反转录成cDNA。采用加入500μL结合缓冲液重悬细胞。先后加入5μL
SYBRGreenRealTimePCR试剂盒检测TRAF6AnnexinV-FITC和5μL碘化丙啶,混匀后于室温下
mRNA表达水平。用GAPDH作为TRAF6的内参,避光孵育15min,然后用流式细胞仪检测各组细胞
使用2−ΔΔct法计算相对表达量。TRAF6正向引物的周期。
5'-ATGCGGCCATAGGTTCTGC-3',反向引物
5'-TCCTCAAGATGTCTCAGTTCCAT-3';
正向引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3',反所有实验重复3次。
向引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。析数据。计量资料用均数±标准差(x±s)表示,两
,多组间比较采用
用RIPA裂解缓冲液分离细胞总蛋白,然后取ANOVA分析。以P<。
20μg总蛋白与SDS-PAGE样品缓冲液煮沸变性后,
进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳转移到2结果
聚偏二氟乙烯膜。使用含5%脱脂奶粉的TBST在
室温下将膜封闭1h后,先加入一抗于4℃-146b的靶基因
夜,再加入二抗于室温孵育1h。用ECL化学发光通过StarBase预测发现TRAF6含有与miR-146b
试剂盒检测并进行曝光拍照,分析蛋白的相对表互补的结合位点(图1A)。双荧光素酶报告基因实
达水平。验验证miR-146b与TRAF6的结合关系(图1B),miR-
-8检测肾小球系膜细胞增殖146bmimic可显著降低TRAF6-WT的荧光素酶活性
取对数生长期的肾小球系膜细胞,以2×103个/孔(P<),而对TRAF6-MUT荧光素酶活性无影响
接种于96孔培养板。细胞分别培养24、48、72和(P>)。
96h后,向每孔中加入10μLCCK-8试剂,于37℃
培养箱中孵育4h,-146b调控TRAF6的表达
波长处测定各孔的吸光度(A值)。采用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测miR-146b对
1516临床与病理杂志,2022,42(7)
TRAF6的调控作用,结果显示过表达miR-146b显miR-146b模拟物显著降低了肾小球系膜细胞中
著抑制了TRAF6mRNA和蛋白的表达(图2)。IL-6、IL-1β和TNF-α的水平(P<);与miR-
146bmimic+NC组相比,miR-146bmimic+TRAF6
-146b靶向TRF6调控肾小球系膜细胞增殖组以上3种细胞炎症因子的水平显著升高
qRT-PCR和蛋白质印迹法证实,TRAF6过表达(P<,图4)。
质粒可显著促进肾小球系膜细胞中TRAF6mRNA
和蛋白的表达水平(图3A)。-146b对肾小球系膜细胞周期的影响
与miR-control组比较,miR-146bmimic组细流式细胞术分析肾小球系膜细胞的周期。
胞增殖能力显著降低(P<);转染TRAF6过表相比于miR-control组,miR-146bmimic组G0/G1
达质粒可部分逆转miR-146b模拟物对肾小球系膜期的细胞显著增多,S期和G2期细胞数量显著减
细胞增殖的抑制作用(P<;图3B,3C)。少(均P<);相比于miR-146bmimic+NC,
miR-146bmimic+TRAF6组G0/G1期的细胞减
-146b对肾小球系膜细胞炎症因子水平的影响少,S期和G2期细胞数量显著增多(均P<,
ELISA结果表明:与miR-control组相比,图5)。
-WT
TRF6-MUT


***
RelativeluciferaseactivityluciferaseRelative

MiR-controlMiR-146bmimic
图1MiR-146b与TRF6的靶向关系验证
Figure1VerifcationoftargetingrelationshipbetweenmiR-146bandTRF6
与miR-control+TRF6-WT比较,***P<。
ComparedwithmiR-control+TRF6-WTgroup,***P<.
ABC
--control
MiR-146bmimicMiR-146bmimic
TRF6

**
***
GAPDH

RelativeexpressionofTRF6mRNARelativeMiR-controlMiR-146bmimicMiR-controlMiR-146bmimicofTRF6expressionproteinRelativeMiR-controlMiR-146bmimic
图2MiR-146b抑制TRF6的表达
Figure2MiR-146binhibitedtheexpressionofTRF6
(A)qRT-PCR检测TRAF6mRNA的表达;(B,C)蛋白质印迹法检测TRAF6蛋白的表达。与miR-control比较,**P<,
***P<。
(A)ExpressionofTRAF6mRNAwasdetectedbyqRT-PCR;(B,C)ExpressionofTRAF6proteinwasdetectedbyWesternblotting.
ComparedwithmiR-controlgroup,**P<,***P<.
MiR-146b通过靶向TRF6减轻狼疮性肾炎肾小球系膜细胞的损伤林梅,等1517
AB
MiR-146bmimic+NCMiR-control
MiR-146bmimic
MiR-146bmimic+NC
MiR-146bmimic+TRF6MiR-146bmimic+TRF6
3P<
P
P
<
<
2

1OD(450nm)

RelativeTRF6mRNARelativelevel

MiR-146bmimic+NCMiR-146bmimic+TRF6012345
Days
C
100
DAPI
P<
80
P<
60
Ki-67
40
20Merge
RelativefuorescenceintensityfuorescenceRelative
0
MiR-control
MiR-control
MiR-146bmimic
MiR-146bmimic
MiR-146bmimic+NC
MiR-146bmimic+NC
MiR-146bmimic+TRF6
MiR-146bmimic+TRF6
图3CCK-8法和免疫荧光染色检测肾小球系膜细胞增殖
Figure3ProliferationofmesangialcellsdetectedbyCCK-8andimmunofuorescentstaining
(A)qRT-PCR检测TRF6mRNA的表达;(B)CCK-8实验检测每组吸光度;(C)免疫荧光染色检测Ki-67阳性细胞(×200)。
(A)ExpressionofTRF6mRNAdetectedbyqRT-PCR;(B)AbsorbanceofeachgroupdetectedbyCCK-8assay;(C)Immunofuorescent
stainingdetectingtheKi-67-positivecells(×200).
250MiR-control
P<-146bmimic
200P<-146bmimic+NC
P<
)MiR-146bmimic+TRF6
–1
P<
150
P<<
100
Content/(pg·mL
50
0
IL-1βIL-6TNF-α
图4各组系膜细胞炎症因子的水平
Figure4Levelsofinfammatoryfactorsinmesangialcellsofeachgroup
1518临床与病理杂志,2022,42(7)
16001600
1200
12001200
900
800800
600
300400400
000
020406080100120020406080100120020406080100120
MiR-controlMiR-146bmimicMiR-146bmimic+NC
100MiR-control
MiR-146bmimic
1200MiR-146bmimic+NC
80P<<-146bmimic+TRF6
900
60
600
40
Proportion/%
300P<<<<
20
0
0204060801001200
MiR-146bmimic+TRF6
G0/G1G2S
图5流式细胞术分析肾小球系膜细胞细胞周期
Figure5Flowcytometryanalysisofglomerularmesangialcellcycle
3讨论著下调,TRAF6显著上调,且可作为诊断和判断
疾病进展的生物标志物[13];下调TRAF6可通过
狼疮性肾炎肾小球系膜细胞过度增殖是肾损抑制核因子-κB(NF-κB)进而抑制肾小球系膜细胞
伤的重要原因[7],抑制肾小球系膜细胞过度增殖炎症反应[14]。本研究通过生物信息学在线数据库
可改善狼疮性肾炎预后。MiRNAs已被证实通过与预测,并通过双荧光素酶报告基因实验证实miR-
靶基因3'UTR结合并负向调控靶基因的表达,在细146b靶向结合TRAF63'UTR并负调控其表达,
胞增殖、迁移、凋亡等多种细胞活动中起重要作miR-146b模拟物抑制了狼疮性肾炎小鼠肾小球系
用[8]。有报道[9]表明miRNAs在狼疮性肾炎中表达膜细胞的增殖和炎症因子的分泌,使较多细胞停
失调,并发挥重要作用。MiR-146b作为miRNAs中滞在G0/G1期;过表达TRAF6显著减弱了上调miR-
的一员,既往研究[5,10]表明:miR-146b在狼疮性肾146b对小鼠肾小球系膜细胞增殖和炎症因子的抑
炎患者中显著下调,且可通过蛋白酪氨酸激酶1/制作用,诱导更多细胞进入S期。
信号转导子与转录激活子1(JAK1/STAT1)信号通综上所述,本研究证实了miR-146b通过靶向
路抑制狼疮性肾炎体外模型的炎症反应和细胞增TRAF6抑制肾小球系膜细胞的增殖,抑制细胞炎性
殖。本研究与该结果相似,通过构建狼疮性肾炎损伤,并阻滞细胞从G0/G1向S期过渡。MiR-146b/
小鼠发现miR-146b可抑制狼疮性肾炎小鼠肾小球TRAF6轴可能成为治疗狼疮性肾炎的重要靶点。
系膜细胞增殖和炎症反应。然而其下游机制尚不
清楚。
TRAF6是TNF超家族和Toll样/白细胞介参考文献
素-1(Toll/IL-1)受体超家族的结合蛋白之一,具有特
殊的结构和生物学功能,可以与多种激酶结合,,[J].皮肤
先天免疫和获得性免疫中发挥重要作用[11]。TRAF6科学通报,2018,35(3):249-257.
与包括系统性红斑狼疮等多种人类疾病密切相关[12]。WUHaijing,
研究显示:狼疮性肾炎患者外周血中miR-146a显lupuserythematosus[J].ChinaMedicalAbstractsofDermatology,
MiR-146b通过靶向TRF6减轻狼疮性肾炎肾小球系膜细胞的损伤林梅,等1519
2018,35(3):249--cateninonlupusnephritisinMRL/
,[J].中lprmice[J].ChineseJournalofIntegratedTraditionalandWestern
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