miR-499a 5p通过靶向Pten减轻嗜铬细胞瘤细胞PC12低氧损伤.pdf

文档介绍：该【miR-499a 5p通过靶向Pten减轻嗜铬细胞瘤细胞PC12低氧损伤 】是由【一主三仆】上传分享，文档一共【6】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【miR-499a 5p通过靶向Pten减轻嗜铬细胞瘤细胞PC12低氧损伤 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。年月基础医学与临床
202212December2022
第卷第期

文章编号:()研究论文
1001⁃6325202212⁃1873⁃06
通过靶向减轻嗜铬细胞瘤细胞低氧损伤
miR⁃499a⁃5pPtenPC12
张丽阳∗,孙军,陈迪
南阳市中心医院神经内科河南南阳
(,473000)
摘要:目的研究对化学性低氧诱导的嗜铬细胞瘤细胞损伤的影响方法将细胞分为
miR⁃499a⁃5p(PC12)。PC12
对照组低氧组处理低氧组和转染组分别转染和
、(CoCl224h)、+miR⁃NCmiR⁃mimic(miR⁃NCmiR⁃499a⁃5pmimic
后用处理用检测表达用法检测细胞活性用试剂盒检测乳酸脱氢酶
,CoCl224h)。RT⁃qPCRmiR⁃499a⁃5p;MTT;
活性用流式细胞测量术检测各组细胞凋亡用检测磷酸酶与张力蛋白同源物蛋白的
(LDH);;Westernblot(PTEN)
表达用荧光素酶报告基因检测是否为的直接作用靶标结果与对照组比较低氧组中
。PtenmiR⁃499a⁃5p。,
表达和细胞活性降低P或P活性和细胞凋亡增加P或P过表达
miR⁃499a⁃5p(<<),LDH(<<);
可提高低氧条件下细胞的存活率并抑制其凋亡P或P是的直
miR⁃499a⁃5pPC12(<<)。PtenmiR⁃499a⁃5p
接作用靶标结论通过靶向减轻细胞低氧损伤
。miR⁃499a⁃5pPtenPC12。
关键词:磷酸酶与张力蛋白同源物细胞低氧损伤
miR⁃499a⁃5p;;PC12;
中图分类号:文献标志码:
R966A
DOI:
.1001⁃
miR⁃499a⁃5palleviateshypoxic
damageofpheochromocytomacellsthroughtargetingatPten
∗
ZHANGLi⁃yang,SUNJun,CHENDi
(DepartmentofNeurology,NanyangCentralHospital,Nanyang473000,China)
AbstractObjective
:TostudytheeffectofmiR⁃499a⁃5poninjuryinducedbychemicalhypoxiaofpheochromocy⁃
Methods
tomacell(PC12).PC12cellsweredividedintocontrolgroup,hypoxiagroup(treatedwithCoCl2for
24h),hypoxia+miR⁃NCormiR⁃;theexpressionof
miR⁃499a⁃5pwasdetectedbyRT⁃qPCR;lactatedehydrogenase(LDH)activitywasdetectedbykit;apoptosiswas
detectedbyflowcytometry;theexpressionofphosphataseandtensinhomolog(PTEN)proteinwasdetectedby
⁃499a⁃5p.
ResultsP
Comparedwithcontrolgroup,thecellviabilityandmiR⁃499a⁃5pexpressiondecreased(<
PPP
<),LDHactivityandapoptosisincreased(<<)⁃expressionof
PP
miR⁃499a⁃5penhancedsurvivalrateandinhibitedapoptosisofPC12cellsunderhypoxia(<<).
Conclusions
PtenwasadirecttargetofmiR⁃499a⁃⁃499a⁃5palleviateshypoxicinjuryofPC12cells
throughtargetingatPten.
Keywords
:miR⁃499a⁃5p;phosphataseandtensinhomolog;PC12cell;hypoxicinjury
收稿日期:修回日期:
2021⁃12⁃082022⁃05⁃22
基金项目:河南省科学技术厅基金
(192102310349)
∗通信作者(correspondingauthor):
******@
基础医学与临床
(12)

(ischemiccerebrovascular
因其高病死率和致残性而成为全球细胞的分组及处理将细胞分为对照
disease,ICVD):PC12
主要的健康问题之一给社会带来了沉重的经济负组低氧组按参文用处理
,、([10]
担[1⁃2]基础和临床研究已经证实由多种因素引低氧和转染组按照转
。,24h)、+miR⁃NCmiR⁃mimic(
起的脑缺氧是的病理生理机制之一并最终染试剂说明书步骤分别将和
ICVD,,miR⁃NCmiR⁃499a⁃5p
导致细胞损伤坏死和凋亡[3⁃5]目前临床药物治转入细胞后用处理
、。,mimic,CoCl224h)。
疗仍存在局限性因此研究的病因机法测定细胞活力将每组细胞接种到
ICVD。,:
制并寻找治疗的新靶标在临床上具有重要意义孔板每孔均加入试剂室温
。96,20μLMTT(5g/L),
源自大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的细孵育加入并待结晶完全溶解
PC123h,100μLDMSO。
胞在形态和功能上与神经元相似用化学缺氧诱用酶标仪测量在处吸光度A值细胞活
。570nm()。
力的计算公式如下细胞活力实验组A值对照组
导剂氯化钴处理的细胞常被用于体:=/
(CoCl2)PC12
A值
外模拟低氧或缺血性微环境造成的神经元损×100%。
释放活性的检测将每组细胞接种到
伤[6⁃7]:
。,miRNAsICVD孔板按试剂盒说明操作各孔均加入
用[8⁃9]是一种进化上高度保守的特异96,,20μL
。miR⁃499a⁃5p释放试剂并室温孵育g离心收
性在脑室中表达丰富[9]然而LDH1h,400×5min,
miRNA,。,miR⁃499a⁃5p集各孔上清液并加到一个新的孔板中每孔加入
表达水平与神经元缺氧损伤的关系仍不清楚96,
。检测液室温避光孵育用酶标
是通过靶基因来发挥其生物学功能[8]60μLLDH,30min。
miRNA。仪测量处A值同时测定已知浓度的
靶基因预测网站570nm。LDH
miRNA(
显示磷酸酶与张力蛋白同源物。LDH(U/L)=
org/),(phosphatase品A值标准品A值标准品浓度
是的潜在靶/×(U/L)。
andtensinhomolog,Pten)miR⁃499a⁃5p检测水平按照
⁃qPCRmiR⁃499a⁃5p:
。,miR⁃499a⁃5p试剂说明提取细胞中总取
节参与调节低氧诱导的细胞损伤TRIzolRNA。1μgRNA,
PtenPC12。按一步法试剂盒说明操作行
RT⁃qPCR,RT⁃qPCR
材料与方法反应反应条件为反转录预变性
1。50℃15min—
个循环变性退火延
材料95℃2min—40(95℃15s—/

细胞试剂与抗体细胞中科院上海细60℃30s)。miR⁃499a⁃5p::5′⁃GC
、:PC12(反向
CGAGGCCCTGTCCCCT⁃3′,:5′⁃CTCAACTGGTG
胞库胎牛血清和培养基公U6的引物正向
);RPMI⁃1640(GibcoTCGTGGA⁃3′;::5′⁃CTCGCTTCGG
司试剂盒公司反向
);CoCl2、MTT(Sigma⁃Aldrich);Lipo⁃CAGCACA⁃3′,:5′⁃AACGCTTCACGAATTTGCG
公司采用-△△Ct法计算的相对表达
fectamine3000(Invitrogen);miR⁃499a⁃5pT⁃3′。2miR⁃499a⁃5p
和水平
mimic、miR⁃NC、⁃⁃Pten。
广州锐博生物公司乳酸脱氢酶流式细胞测量术检测细胞凋亡按试剂盒说
();(lactatedehydro⁃:
活性试剂盒蛋白质测定试剂盒明操作将各组细胞分别室温避光孵育
genase,LDH)、BCA、,annexin
TM基因定点突变试剂盒TM和溶液各将细胞混合液添加到
QuickMutation、Dual⁃LumiV⁃FITCPI15min。
双萤光素酶报告基因检测试剂盒和细胞染流管中设置流式细胞仪激发波长为并将
TUNEL,488nm,
色试剂盒上海碧云天生物公司试剂滤光片设置为以检测荧光将设置
();Trizol、515nmFITC,PI
细胞凋亡检测试剂盒和一步法为随后对细胞进行凋亡率检测
annexinV⁃FITC/PI560nm,。
试剂盒江苏凯基生物公司鼠源双萤光素酶报告基因检测靶向关系用基因
RT⁃qPCR();:
抗体公司鼠源抗体和定点突变试剂盒将与具有预测结合位
(SantaCruz);GAPDHHRPmiR⁃499a⁃5p
标记羊抗鼠抗体北京百奥莱博生物公点的的区基因序列突变通过扩
IgG(H+L)(Pten3′⁃UTR,PCR
司增的野生和突变的区域
)。Pten(Wt)(Mut)3′⁃UTR,
张丽阳通过靶向减轻嗜铬细胞瘤细胞低氧损伤
miR⁃499a⁃5pPtenPC121875

Pten3′⁃UTRpGL6⁃
载体分别将使用软件对所有数据进行统计分
MIR。miR⁃NC+Pten⁃Wt、miR⁃499a⁃
和析所有数据以均数标准差xs表示组间均
mimic+Pten⁃Wt、miR⁃NC+Pten⁃MutmiR⁃499a⁃5p。±(±)。
共转入细胞后按双萤数两两比较用单向方差分析事后检验
mimic+Pten⁃MutPC1248h,LSD。
光素酶报告基因检测试剂盒说明进行萤火虫萤光
,2结果
素酶相对光单位值和海肾
(relativelightunit,RLU)
⁃499a⁃5p的表达
RLU。=
光素酶值海肾萤光素酶值降低
RLU/RLU×100%。
检测蛋白水平按常规与对照组比较低氧均能使细胞
:,6~24hPC12
法行蛋白提取和与和中表达明显降低P或P
Westernblot。PTEN(1∶500)miR⁃499a⁃5p(<<
抗体下孵育过夜洗涤后与低氧组比较转染组
GAPDH(1∶3000)4℃。,);,miR⁃mimicmiR⁃
标记羊抗小鼠二抗室温的表达明显升高P图
HRPIgG(H+L)(1∶1000)499a⁃5p(<)(1)。
⁃499a⁃5p抑制低氧诱导的PC12
1h。Bio⁃RadGelDocEZ
进行成像使用分析蛋白条带的A值细胞损伤
。ImageJ。
相对表达水平的A值的A值与对照组比较低氧组细胞活力明显降低P
PTEN=PTEN/GAPDH,(<
活性和凋亡水平均明显增高P
×100%。),LDH(<
功能修复实验检测细胞活性释放活或P与低氧组比较转染组细
、LDH<);,miR⁃mimic
性和阳性细胞比例分别将胞活力明显增加P活性和凋亡水平
TUNEL:miR⁃NC+(<),LDH
和均明显降低P图
⁃SC、miR⁃499a⁃5pmimic+⁃SC(<)(2)。
⁃499a⁃5p的靶基因
miR⁃499a⁃5pmimic+⁃PtenPC12
胞并构建组低氧与共转染组比较
,miR⁃NC+⁃SC、+miR⁃NC+miR⁃NC+Pten⁃Wt,miR⁃mimic
组低氧共转染组荧光活性明显降低P
⁃SC、+miR⁃mimic+⁃SC+Pten⁃Wt(<);
组和低氧组按照试但共转染组与
+miR⁃mimic+⁃Pten。miR⁃mimic+Pten⁃MutmiR⁃NC+Pten⁃
剂盒说明操作用法检测各组细胞活性用共转染组之间的荧光活性无明显差异与
,MTT,Mut;
试剂盒检测各组释放活性用法转染组比较转染组细胞
LDHLDH,TUNELmiR⁃NC,miR⁃mimicPC12
检测各组阳性细胞比例中表达明显降低P图
TUNEL。PTEN(<)(3)。
⁃499a⁃5pinPC12cellsundernormoxia(controlgroup)anddifferenthypoxiaduration;
∗P∗∗P#P
ofmiR⁃499a⁃5pinPC12cellsineachgroup;<,<;<
withhypoxiagroup
图1miR⁃499a⁃5p在低氧条件下的表达
Fig1ExpressionofmiR⁃499a⁃5punderhypoxiccondition(x±s,n=3)
基础医学与临床
(12)
∗P∗∗P
;;;<,<
#P##P
comparedwithcontrolgroup;<,<
图2过表达miR⁃499a⁃5p抑制低氧诱导的PC12细胞损伤
Fig2Over⁃expressionofmiR⁃499a⁃5pinhibitedhypoxia⁃inducedinjuryofPC12cells(x±s,n=3)
⁃499a⁃5p;
∗P∗∗P
withmiR⁃499a⁃5pmimic,theexpressionofPTENinPC12cellswasdetectedbyWesternblot;<,<
comparedwithmiR⁃NCgroup
图3Pten是miR⁃499a⁃5p的直接作用靶标
Fig3PtenwasadirecttargetofmiR⁃499a⁃5p(x±s,n=3)
⁃Pten部分消除miR⁃499a⁃5p对组细胞活力明显降低P
⁃SC(<),
PC12细胞低氧损伤的保护作用活性和凋亡水平明显增高P与低氧
LDH(<);+
与组比较低氧组比较低氧
miR⁃NC+⁃SC,+miR⁃NC+miR⁃NC+⁃SC,+miR⁃mimic+
张丽阳通过靶向减轻嗜铬细胞瘤细胞低氧损伤
miR⁃499a⁃5pPtenPC121877
组细胞活力明显回升P的神经元损伤并没有明确可行的办法造成
⁃SC(<),。ICVD
活性和凋亡水平明显下降P或的脑损伤伴有多种病理特征在这些病理因素中缺
LDH(<,,
P与低氧组比氧是导致神经元细胞损伤的重要因素[3⁃5]
<);+miR⁃mimic+⁃SC。CoCl2
较低氧组细胞活力明诱导的细胞低氧损伤模型已广泛用于模拟与
,+miR⁃mimic+⁃PtenPC12
显降低P活性和凋亡水平明显增高低氧相关的神经系统疾病[6⁃7]因此本研究选用
(<),LDH,,
P图诱导的细胞低氧损伤模型已
(<)(4)。CoCl2PC12。miRNAs
被证实在低氧造成的组织损伤中发挥调控作
3讨论
用[8⁃9]但家族庞大在低氧中发挥调控作
。miRNA,
目前以对症治疗为主而对造成用的需要筛选据报道[11⁃12]在缺血缺氧
,ICVD,ICVDmiRNA。,、
;;
∗P#P##P
(scalebar=20μm);<⁃NC+⁃SCgroup;<,<⁃
△P
poxia+miR⁃NC+⁃SCgroup;<+miR⁃mimic+⁃SCgroup
⁃Pten部分消除miR⁃499a⁃5pmimic对神经元缺氧损伤的保护作用
⁃PtenpartiallyeliminatedtheprotectiveeffectofmiR⁃499a⁃5pmimiconneuronalhypoxia
injury(x±s,n=3)
基础医学与临床
(12)
或氧化应激的刺激下心肌组织或细胞中的达来实现的[8]靶基因预测网站显示
,miR⁃499。miRNAPten
表达水平明显下调另外最近一项研究[13]表明是的潜在候选靶基因之一已有研
。,miR⁃499a⁃5p。
可减轻脑缺血再灌注损伤本研究究[14]表明在氧糖剥夺条件下细胞中
miR⁃499a⁃5p/。,,PC12Pten
显示在低氧条件下的细胞中呈上调而敲降能抑制氧糖剥夺诱导的
,PC12miR⁃499a⁃5p,PTENPC12
下调表达而过表达能减少低氧诱导细胞凋亡和存活降低本研究显示是
,miR⁃499a⁃5p。,Pten
的细胞损伤这与上述文献的结果相符合发挥抗低氧诱导的细胞损伤的
,。miR⁃499a⁃5pPC12
发挥生物学功能是通过调节靶基因表靶基因
miRNA。
参考文献:
etal
[1]HuX,DeSilvaTM,ChenJ,.Cerebralvasculardis⁃[8]ShenG,⁃brainbarrierin
easeandneurovascularinjuryinischemicstroke[J].Circhypoxic⁃ischemicbraininjury[J].CurrNeuropharmacol,
Res,2017,120:449⁃,18:1180⁃1186.
彭琴李海玲王媛等年中国人群脑血etal
[2],,,.1990—2016[9]OzkulY,TaheriS,BayramKK,.Aheritableprofile
管病疾病负担变化趋势中华流行病学杂志
[J].,ofsixmiRNAsinautisticpatientsandmousemodels[J].
2019,40:400⁃,2020,10::⁃020⁃
[3]TenVS,⁃ischemicinjuryinthedevel⁃65847⁃8.
etal
opingbrain:theroleofreactiveoxygenspeciesoriginating[10]ZhongQ,ZhouY,YeW,.Hypoxia⁃induciblefactor
inmitochondria[J].NeurolResInt,2012,2012:1⁃a⁃AA⁃modifiedbonemarrowstemcellsprotectPC12
:⁃inducedapoptosis,partiallythrough
etal
[4]ZolotoffC,VoirinAC,PuechC,.IntermittenthypoxiaVEGF/PI3K/Akt/FoxO1pathway[J].StemCellsDev,
anditsimpactonNrf2/HIF⁃1alphaexpressionandABC2012,21:2703⁃2717.
invitroetal
transporters:anhumanblood⁃brainbarriermodel[11]WangJ,JiaZ,ZhangC,.miR⁃499protectscardio⁃
study[J].CellPhysiolBiochem,2020,54:1231⁃⁃inducedapoptosisviaitseffectson
etal
[5]BeaudinAE,WaltzX,HanlyPJ,.Impactofob⁃Pdcd4andPacs2[J].RNABiol,2014,11:339⁃350.
etal
structivesleepapnoeaandintermittenthypoxiaoncardio⁃[12]ZhuJ,YaoK,WangQ,.Ischemicpostconditioning⁃
vascularandcerebrovascularregulation[J].ExpPhysiol,regulatedmiR⁃499protectstheratheartagainstischemia/
2017,102:743⁃
etal
[6]KimJJ,KangYJ,ShinSA,.Phlorofucofuroeckol[J].CellPhysiolBiochem,2016,39:2364⁃2380.
etal
improvesglutamate⁃inducedneurotoxicitythroughmodula⁃[13]LiY,LuJ,BaoX,.miR⁃499⁃5pprotectscardiomy⁃
tionofoxidativestress⁃mediatedmitochondrialdysfunctionocytesagainstischaemicinjuryviaanti⁃apoptosisbytargeting
inPC12cells[J].PLoSOne,2016,11::PDCD4[J].Oncotarget,2016,7:35607⁃35617.
etal
.0163433.[14]ZhengT,ShiY,ZhangJ,.miR⁃130aexertsneuro⁃
于玮邓秀玲马真等雌马酚对细胞缺氧复
[7],,,.PC12/protectiveeffectsagainstischemicstrokethroughPTEN/
氧损伤的保护作用及其机制南方医科大学学报
[J].,PI3K/AKTpathway[J].BiomedPharmacother,2019,
2016,36:1⁃::..