文档介绍：年生物化学实验B
实验报告
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小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量、SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量

摘要本实验从新鲜且冷冻保存的小牛肠出发,通过刮取、离心分离、析出、提纯等方式提取小牛肠中碱性磷酸酶,利用紫外分光光度法测定该酶的活性,并利用考马斯亮蓝法测定所提取的蛋白质含量,最后通过SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳对比marker谱带近似得出蛋白样品中蛋白质的相对分子量。
关键词碱性磷酸酶;分离纯化;酶活;紫外分光光度法;考马斯亮蓝;蛋白质;聚丙烯酰***凝胶;蛋白质分子量。
前言
碱性磷酸酶能催化核酸分子脱掉5’-磷酸基团,从而使DNA或RN***段的5’-P末端转换成5’-OH末端。主要应用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。
本实验以小牛肠为原料,分离纯化小牛肠碱性磷酸酶并研究酶活。小牛肠碱性磷酸酶的分子量为145000,,使之水解释放出对硝基苯酚,后者在405nm光波长下有最大吸收。通过测定吸光值的变化率,可测定酚的生成量,从而计算出酶的活性单位。
应用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量,该反应非常灵敏,可测微克级蛋白质含量,是一种常用的蛋白质快速微量测定法。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中的游离状态呈红褐色,当它与蛋白质结合后变为蓝色,前者最大吸收波长为465nm,后者为595nm。在一定蛋白浓度范围内(~),蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量分析。应用SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳法测定蛋白酶分子质量,根据标准样品在电泳中所做出的标准曲线,推算出被测蛋白样品分子量的近似值。 1 实验部分
试剂与仪器

(1)正丁醇、***(置-20℃冰箱保存);
(2)1 mol/L 醋酸(HAc),1 mol/L NaOH,硫酸铵;
(3)平衡缓冲液: mol/L Tris-HCl,pH=;
(4)底物缓冲液:1 mol/L 二乙醇***-盐酸缓冲液,pH=;
(5)酶的底物溶液:用底物缓冲液配制15×10-3 mol/L 对硝基苯磷酸二钠溶液(已加入到底物缓冲液中);
(6)30% 丙烯酰***(acrylamide,Acr)置棕色瓶;
(7)分离胶缓冲液: mol/L Tris-HCl缓冲液,pH=,已加入10% SDS;
(8)浓缩胶缓冲液: mol/L Tris-HCl缓冲液,pH=,已加入10% SDS;
(9)10% 过硫酸铵(AP)(小离心管装,提供驱动丙烯酰***和双丙烯酰***的聚合所
必需的自由基,需新鲜配制);
(10)TEMED(四***乙二***)(小离心管装T,通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰***与双丙烯酰***的聚合);
(11)上样缓冲液(小离心管装S):称100 mg SDS、2 mg溴酚蓝、2 g甘油, mL巯基乙醇、2 mL pH Tris-HCl,加超纯水定容至10 mL;
(12)染色液:% 考马斯