文档介绍：lip2000转染说明书
Invitrogen的细胞转染试剂:Lipofectamine 2000 Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。已知可为517种细胞(见下面连接地址)提供高转染效率(表达转基因细胞的百分数)和活性(细胞抽提物中转入基因的酶产物活性)。特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便:
(1)DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中,有血清也不怕
(2)转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂,无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单:稀释DNA以及Lipofectamine 2000,混合2种稀释液保温20分钟,加入培养细胞中孵育24-96小时检测结果。下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺板,使其在转染日密度为90%。,不含抗生素的正常生长的培养基中。
对于每孔细胞,使用50μl无血清培养基(如OPTI-MEMⅠ培养基)- DNA。对于每孔细胞,使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟(在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。) 注意:即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释,细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液,必须在5
分钟内同稀释的DNA混合。
混合稀释的DNA(第2步)和稀释的Lipofectamine 2000(第3步)。在室温保温20分钟。
注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。
直接将复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。
注意:如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基,。
在37℃,5%的CO2中保温24-48小时,无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
在细胞中加入复合物24-72小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
对于96孔板培养,不再需要提前一天进行细胞铺板,而可以直接在平板中制备复合物,然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了,这样进一步减少了转染时间。这种改进步骤已经过293-H,293-F,COS-7L和CHO细胞的试验,同传统方法相比活性稍低。快捷的步骤和蛋白表达细胞系的高效转染使得Lipofectamine 2000非常适用于96孔板的高通量转染,比如cDNA文库的筛选和蛋白瞬时表达。
适用细胞株范围不同的转染试剂所适用的细胞株范围各不相同。一个实验室常常会用到不止一种细胞株,甚至是比较特殊的细胞株。一个
转染试剂所适用的细胞株越多,当然越受用户的欢迎。根据Invotrogen网站的资料,Lipofectamine 2000已经证实可用于高达517种细胞株,覆盖了相当广的范围。要看看Lipofectamine 2000是否适用于你现有的细胞株,可以访问以下Invitrogen网址
(?pageID=9559&fuseaction=) 适用的核酸类型和DNA大小有的转染试剂是为siRNA转染而设计的,有的则是为DNA转染设计。Lipofectamine 2000可以适用于包括DNA,siRNA, dsRNA, 荧光标记的Oligo, RNA等在内的核酸转染,这使得Lipofectamine 2000适用范围非常广泛,无论是基因表达分析的DNA转染,或者是RNAi,Lipofectamine 2000都能胜任,这样你就不需要为不同目的购买不同试剂了。值得注意的是,最常用的DNA转染中有一个DNA大小的问题,太大的质粒不那么好转。我们暂时还没有找到Lipofectamine 2000相应的资料。
用量和价格好东西往往不便宜。可是在实验室中,价格往往是最具有杀伤力的。
Lipofectamine 2000用的剂量大吗?价格如何?根据说明书,24孔板转染每次用2ul左右,
Lipofectamine 2000大约可做750次24孔板转染,或者大约150次6孔板转染,而
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