文档介绍：Invitrogen 的细胞转染试剂: Lipofectamine 2000 Lipofectamine 2000 是最为人熟知的转染产品之一。已知可为 517 种细胞(见下面连接地址) 提供高转染效率( 表达转基因细胞的百分数) 和活性( 细胞抽提物中转入基因的酶产物活性)。特点两个关键性特点使得 Lipofectamine 2000 试剂的转染步骤快速简便: (1) DNA- 阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中,有血清也不怕(2 )转染后不需要除去 Lipofectamine 2000 试剂,无需换培养基操作流程事实上 Lipofectamine 系列产品操作流程都是又快又简单:稀释 DNA 以及 Lipofectamine 2000 ,混合 2 种稀释液保温 20 分钟,加入培养细胞中孵育 24 - 96 小时检测结果。下面是 Invitrogen 提供的详细流程和注意事项。转染前一天, 胰酶消化细胞并计数, 细胞铺板, 使其在转染日密度为 90% 。细胞铺板在 l 含血清,不含抗生素的正常生长的培养基中。对于每孔细胞, 使用 50 μl 无血清培养基(如 OPTI-MEM Ⅰ培养基) 稀释 μ g- μg DNA 。对于每孔细胞,使用 50 μl OPTI-MEM Ⅰ培养基稀释 1μ l-3 μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。 Lipofectamine 2000 稀释后保温 5 分钟(在 30 分钟内同稀释的 DNA 混合。保温时间过长会降低活性。) 注意: 即使 Lipofectamine 2000 使用 OPTI-MEM Ⅰ稀释, 细胞也可以使用 D-MEM 培养。如果 D-MEM 做为 Lipofectamine 2000 的稀释液, 必须在 5 分钟内同稀释的 DNA 混合。混合稀释的 DNA (第 2 步)和稀释的 Lipofectamine 2000 (第 3 步)。在室温保温 20 分钟。注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。复合物可以在室温保持 6 小时稳定。直接将复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。注意: 如果在无血清条件下转染, 使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基,替换为无血清培养基。在 37 ℃,5 %的 CO2 中保温 24-48 小时,无须去掉复合物或更换培养基或者在 4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。在细胞中加入复合物 24-72 小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达, 在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。对于 96 孔板培养,不再需要提前一天进行细胞铺板,而可以直接在平板中制备复合物, 然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了, 这样进一步减少了转染时间。这种改进步骤已经过 293-H , 293-F , COS-7L 和 CHO 细胞的试验,同传统方法相比活性稍低。快捷的步骤和蛋白表达细胞系的高效转染使得 Lipofectamine 2000 非常适用于 96 孔板的高通量转染, 比如 cDNA 文库的筛选和蛋白瞬时表达。适用细胞株范围不同的转染试剂所适用的细胞株范围各不相